劉佳，李莉，胡會娟，商彤，孟磊，李永杰，魏勝利，4*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100035；3.北京市中藥研究所，北京 100035；4.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102)

·基礎(chǔ)研究·

不同道地產(chǎn)區(qū)大黃功效組分含量的差異分析△

劉佳1，李莉2，3，胡會娟1，商彤1，孟磊1，李永杰1，魏勝利1，4*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100035；3.北京市中藥研究所，北京 100035；4.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102)

目的：分析大黃8個道地產(chǎn)區(qū)4種功效組分(游離蒽醌類、結(jié)合蒽醌類、酚酸類和二蒽酮類)14種活性成分的含量和比例差異，為研究其在“清熱解毒、瀉下攻積、逐淤通經(jīng)”三種功效活性上的潛在優(yōu)勢提供參考。方法：采用HPLC進行含量測定，利用SPSS進行方差分析。結(jié)果：不同道地產(chǎn)區(qū)大黃4種功效組分含量之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中，游離蒽醌類物質(zhì)含量以銓水大黃最高，西寧大黃和河州大黃次之；結(jié)合蒽醌和二蒽酮類成分含量以莊浪大黃最高，西寧大黃和雅黃次之；而酚酸類物質(zhì)含量最高的為涼黃，西寧大黃和銓水大黃次之。結(jié)論：結(jié)合不同成分的藥理學(xué)活性，銓水大黃、西寧大黃和河州大黃在清熱解毒功效上具有潛在優(yōu)勢，莊浪大黃、西寧大黃和雅黃在瀉下攻積功效上具有潛在優(yōu)勢，而同時西寧大黃、銓水大黃和涼黃在逐瘀通經(jīng)功效上具有潛在優(yōu)勢，上述結(jié)果對于指導(dǎo)大黃精準(zhǔn)用藥具有重要意義。

道地藥材；大黃；活性成分；功效組分

道地藥材是我國傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)中藥材的代名詞[1]，有些藥材同時存在多個道地產(chǎn)區(qū)，如白芍中的“杭白芍”和“亳白芍”，大黃中的“銓水大黃”、“莊浪大黃”、“西寧大黃”等。對此，無法單獨從“優(yōu)質(zhì)”的維度分析，因為最優(yōu)質(zhì)的只能有一個。因此，筆者給出另一種解釋，即：由于中藥材是多功效、多組分的復(fù)雜體系，不同道地產(chǎn)區(qū)的藥材可能在不同功效、不同功效組分含量上表現(xiàn)為不同的專長，即：有可能分別在不同功效上表現(xiàn)出專長。為驗證上述猜想，本實驗以多道地產(chǎn)區(qū)并存藥材大黃為對象，開展了研究工作。

大黃為傳統(tǒng)的大宗中藥材，來源于蓼科掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃Rheum.tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum.officinaleBaill.的干燥根及根莖[2]，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、活血化瘀等多種功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，與上述功效相關(guān)的成分為結(jié)合蒽醌類、二蒽酮類、游離蒽醌類和酚酸類物質(zhì)[3]。此外，根據(jù)歷代本草關(guān)于大黃產(chǎn)地的記載，大黃有8個道地產(chǎn)區(qū)，分別為甘肅地區(qū)的“涼州大黃”、“銓水大黃”、“清水大黃”、“莊浪大黃”、“岷縣大黃”和“河州大黃”，青海地區(qū)的“西寧大黃”和四川地區(qū)的“雅黃”[4]。截至目前，關(guān)于不同產(chǎn)地、不同道地產(chǎn)區(qū)大黃部分活性成分含量和指紋圖譜的差異已有部分報道[5-7]，但是，基于大黃傳統(tǒng)功效區(qū)分功效組分系統(tǒng)比較不同道地產(chǎn)區(qū)大黃質(zhì)量差異的研究尚未報道。本文對8個道地產(chǎn)區(qū)大黃的4種功效組分(包含大黃素、大黃酸、大黃酚、番瀉苷A、番瀉苷B、兒茶素等14種活性成分)的含量和比例進行了研究，其結(jié)果對于道地藥材質(zhì)量評價和指導(dǎo)大黃臨床精準(zhǔn)用藥具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1材料

實驗材料為采自大黃8個道地產(chǎn)區(qū)的114份大黃根及根莖(圖1，表1)，經(jīng)統(tǒng)一干燥后作為分析樣品。樣品標(biāo)本經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)魏勝利教授鑒定為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.和唐古特大黃Rheum.tanguticumMaxim.ex Balf.的根及根莖。

圖1 大黃道地產(chǎn)區(qū)分布及采集地點

道地名稱基原采集地點經(jīng)度緯度海拔/m樣本量雅黃掌葉大黃四川新龍E100°25'52.89″N30°52'54.89″43675掌葉大黃四川小金E102°26'50.81″N31°28'07.06″30833掌葉大黃四川爐霍E100°39'56.91″N31°23'54.51″31665掌葉大黃四川康定E101°45'40.80″N30°13'36.41″40775掌葉大黃甘肅迭部E103°39'40.62″N34°05'41.26″32274唐古特大黃四川松潘E103°34'54.37″N32°49'32.84″32825唐古特大黃四川唐克E102°27'41.74″N33°21'11.73″34474唐古特大黃四川德格E099°10'28.20″N31°56'43.83″39345西寧大黃唐古特大黃青海久治E101°30'29.05″N33°30'33.29″36495唐古特大黃青海祁連E100°12'59.18″N38°09'36.25″29815唐古特大黃青海貴德E101°14'37.38″N36°14'04.01″37287唐古特大黃青海同德E100°27'08.02″N35°04'23.22″37286唐古特大黃青海達日E099°42'15.39″N33°44'38.56″39815

表1(續(xù))

1.2儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀，包括四元泵、真空脫氣泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD二極管陣列檢測器；SartoriusBP211D(百萬分之一)電子分析天平(上海賽多利斯儀器有限公司)、METTLERAE240(十萬分之一)電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ5200D超聲清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；FW100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

乙腈(FisherScientific)為色譜純，甲醇、磷酸等試劑均為分析純，對照品蘆薈大黃素、大黃素甲醚、番瀉苷A、番瀉苷B、兒茶素(成都普非德生物技術(shù)有限公司，純度>98%，批號分別為：120925、121025、120815、120906、121210)，大黃素、沒食子酸(成都曼斯特生物科技有限公司，純度>98%，批號分別為：MUST-12022715、MUST-13040103)；大黃酸、大黃酚(中國食品藥品檢定研究院，純度>98%，批號分別為：110757-200206、110796-201118)。

2 方法

2.1色譜條件

2.1.1游離蒽醌類、酚酸類、二蒽酮類物質(zhì)色譜條件 色譜條件[8]：流動相為0.05%的磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序如下：0min，5%B；10min，11%B；30min，15%B；45min，17%B；60min，22%B；75min，36%B；90min，60%B；110min，60%B；125min，5%B。流速1.0mL·min-1；檢測波長254nm；柱溫40℃；進樣量10μL。見圖2。

注：A.對照品；B.樣品；1.沒食子酸；2.兒茶素；3.番瀉苷B；4.番瀉苷A；5.蘆薈大黃素；6.大黃酸；7.大黃素；8.大黃酚；9.大黃素甲醚。圖2 大黃9種活性成分HPLC圖

2.1.2總蒽醌類物質(zhì)色譜條件 色譜條件[8]：流動相為0.05%的磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序如下：0min，50%B；6min，53%B；10min，58%B；14min，70%B；16min，85%B；20min，85%B；22min，50%B。流速1.0mL·min-1；檢測波長254nm；柱溫20℃；進樣量20μL。見圖3。

注：A.對照品；B.樣品；1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚。圖3 大黃5種總蒽醌HPLC圖

2.2對照品溶液制備

精密稱取大黃素甲醚、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素對照品適量，加甲醇溶解配置成0.129、0.246、0.234、0.165、0.042mg·mL-1游離蒽醌混合對照品溶液和0.238、0.852、0.348、0.888、0.596mg·mL-1總蒽醌混合對照品溶液。

精密稱取沒食子酸、兒茶素對照品適量，加60%甲醇溶解配置成0.091、1.04mg·mL-1混合對照品溶液。

精密稱取番瀉苷A、番瀉苷B對照品適量，加60%甲醇溶解配置成0.8、0.53mg·mL-1混合對照品溶液。

2.3供試品溶液制備

2.3.1游離蒽醌類、酚酸類、二蒽酮類物質(zhì)的供試品溶液制備 精密稱取大黃粉末(過60目篩)1g，置于具塞三角瓶中，精密加入60%甲醇50mL，稱定重量，超聲提取1h(200W，40kHZ)，放冷，稱重，用60%甲醇補足損失的重量，搖勻，過濾(0.22μm微孔濾膜)。

2.3.2總蒽醌類物質(zhì)的供試品溶液制備 精密稱取大黃粉末(過60目篩)約0.15g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱重，加熱回流1h，放冷，稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5mL，置燒瓶中，蒸干，加8%鹽酸溶液10mL，超聲處理2min，加三氯甲烷10mL，加熱回流1h，放冷，置分液漏斗中，少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液用三氯甲烷提取3次，每次10mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(0.22μm微孔濾膜)，取續(xù)濾液，即得。結(jié)合蒽醌類樣品含量為總蒽醌類樣品含量減去游離蒽醌類樣品含量。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察

2.4.1.1游離蒽醌、酚酸類、二蒽酮類成分線性關(guān)系考察 在上述色譜條件下，精密吸取對照品溶液10μL進樣，以峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，對照品質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)(X)繪制成分標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程、相關(guān)系數(shù)等，如表2所示。

表2 游離蒽醌、酚酸類、二蒽酮類成分回歸方程

2.4.1.2 總蒽醌類成分線性關(guān)系考察 在上述色譜條件下，精密吸取對照品溶液20 μL進樣，以峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，對照品質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)(X)繪制成分標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)等，如表3所示。

表3 結(jié)合蒽醌類成分回歸方程

2.4.2 精密度考察

2.4.2.1 游離蒽醌、酚酸類、二蒽酮類成分精密度考察 精密吸取2.2項下對照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進樣 5 次，記錄游離蒽醌、酚酸類、二蒽酮類成分峰面積并計算RSD，分別為 1.2%、1.9%、1.8%、1.5%、2.5%、2.1%、1.4%、2.0%、1.3%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2.2 結(jié)合蒽醌類成分精密度試驗 精密吸取2.2項下對照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進樣5次，記錄5種總蒽醌類成分的峰面積并計算RSD，分別為 1.7%、1.3%、1.1%、2.1%、1.0%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性考察

2.4.3.1 游離蒽醌、酚酸類、二蒽酮類化學(xué)成分重復(fù)性試驗 按照2.3項下供試品溶液制備方法，同一樣品制備5份，按上述色譜條件進樣，記錄游離蒽醌、酚酸類、二蒽酮類成分峰面積并計算 RSD，分別為1.78%、0.77%、2.69%、2.16%、1.76%、2.88%、1.32%、2.89%、1.66%，表明重復(fù)性良好。

2.4.3.2 總蒽醌類成分重復(fù)性試驗 按照2.3項下供試品溶液制備方法，同一樣品制備5份，按上述色譜條件進樣，記錄總蒽醌類成分峰面積并計算RSD，分別為0.68%、2.39%、1.82%、0.74%、0.88%，表明重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察

2.4.4.1 游離蒽醌、酚酸類、二蒽酮類化學(xué)成分穩(wěn)定性試驗 精密吸取2.3項下供試品溶液，按上述色譜條件，分別于2、4、6、8、10、12 h進行測定，記錄游離蒽醌、酚酸類、二蒽酮類成分峰面積并計算RSD，分別為2.39%、2.76%、3.13%、2.08%、2.86%、1.73%、2.44%、1.67%、2.54%，表明樣品在室溫下放置 12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4.2 總結(jié)合蒽醌類成分穩(wěn)定性試驗 精密吸取2.3項下供試品溶液，按上述色譜條件，分別于2、4、6、8、10、12 h 進行測定，記錄總蒽醌類成分峰面積并計算RSD，分別為1.00%、0.72%、2.21%、0.75%、0.97%，表明樣品在室溫下放置 12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率

2.4.5.1 游離蒽醌、酚酸類、二蒽酮類化學(xué)成分加樣回收率 精密稱取大黃樣品6份，精密加入相應(yīng)游離蒽醌、酚酸類、二蒽酮類成分對照品，按照供試品溶液制備方法處理，按上述色譜條件進樣，回收率為99.65%、103.26%、101.68%、101.12%、98.03%、99.80%、101.21%、101.75%、99.98%，RSD為2.6%、1.0%、2.7%、1.2%、1.6%、2.0%、2.5%、1.3%、1.2%。

2.4.5.2 總結(jié)合蒽醌類成分加樣回收率 精密稱取大黃樣品6份，精密加入相應(yīng)總蒽醌類成分對照品，按照供試品溶液制備方法處理，按上述色譜條件進樣，回收率為99.03%、102.21%、101.35%、101.62%、97.09%，RSD分別為 1.540%、2.410%、1.399%、1.351%、2.666%。

2.5數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果與分析

3.1不同道地產(chǎn)區(qū)大黃游離蒽醌類成分含量差異分析

不同道地產(chǎn)區(qū)間大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和總游離蒽醌含量差異具有非常顯著性意義(P<0.01)(表4)。其中，大黃酸和大黃素含量最高的為西寧大黃，分別為(0.366±0.23)%和(0.13±0.05)%，含量最低的為岷縣大黃，分別為(0.05±0.02)%，(0.02±0.01)%；大黃酚、大黃素甲醚和總游離蒽醌類成分含量最高的為銓水大黃，分別為(0.48±0.14)%、(0.24±0.06)%和(1.21±0.27)%，不同道地產(chǎn)區(qū)大黃按總游離蒽醌含量排序為：銓水大黃>西寧大黃>河州大黃>莊浪大黃、雅黃>涼黃>岷縣大黃。

表4 不同道地產(chǎn)區(qū)大黃游離蒽醌類成分含量(%)

3.2 不同道地產(chǎn)區(qū)大黃結(jié)合蒽醌類成分含量差異分析

不同道地產(chǎn)區(qū)大黃的蘆薈大黃素苷和大黃酚苷含量差異具有顯著性意義(P<0.05)，大黃酚苷、大黃素甲醚苷和總結(jié)合蒽醌類成分含量差異具有非常顯著性意義(P<0.01)(表5)。8個道地產(chǎn)區(qū)中以莊浪大黃的大黃酚苷、大黃素甲醚苷及總結(jié)合蒽醌含量最高，分別為(2.86±2.5)%、(2.12±1.9)%和(6.13±4.80)%，不同道地產(chǎn)區(qū)大黃按總結(jié)合蒽醌含量排序為：莊浪大黃>西寧大黃>雅黃>河州大黃>涼黃>清水大黃>岷縣大黃>銓水大黃。

表5 不同道地產(chǎn)區(qū)大黃結(jié)合蒽醌類成分含量(%)

3.3 不同道地產(chǎn)區(qū)大黃酚酸類和二蒽酮類成分含量差異分析

不同道地產(chǎn)區(qū)大黃兒茶素和兩種二蒽酮類成分含量差異具有非常顯著性意義(P<0.01)(表6)，其中以涼黃兒茶素(1.24±0.32)%和總酚酸類成分(1.45±0.35)%含量最高。二蒽酮類成分中，番瀉苷A、番瀉苷B含量最高的分別為涼黃和莊浪大黃，為(0.22±0.09)%、(0.25±0.14)%，而二蒽酮類成分總量最高為雅黃，可到(0.41±0.27)%。不同道地產(chǎn)區(qū)大黃按總酚酸類成分含量排序為：雅黃>涼黃>西寧大黃>莊浪大黃>銓水大黃>河州大黃>岷縣大黃>清水大黃。

表6 不同道地產(chǎn)區(qū)大黃酚酸類和二蒽酮類成分含量(%)

4 結(jié)論與討論

4.1 不同道地產(chǎn)區(qū)大黃功效組分含量和比例差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

本研究表明，不同道地產(chǎn)區(qū)大黃14種活性成分除蘆薈大黃素、大黃酸苷和沒食子酸之外，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。按化合物分類，則4種功效組分含量之間差異具有非常顯著性意義，如對不同道地藥材按照各類功效組分含量比例作圖(圖4)，則會發(fā)現(xiàn)，不同道地產(chǎn)區(qū)大黃在功效組分含量比例上差異同樣具有顯著性意義。根據(jù)道地藥材的形成機制[4，9]，這種差異的形成既與不同產(chǎn)區(qū)大黃基原和種內(nèi)地理變異有關(guān)，又與不同道地產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境的差異有關(guān)。

圖4 不同道地產(chǎn)區(qū)大黃功效組分差異圖

4.2不同道地產(chǎn)區(qū)大黃功效組分含量和比例差異可能導(dǎo)致其不同功效活性差異

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃中游離蒽醌類成分與其“清熱解毒”功效相關(guān)[10-11]，結(jié)合蒽醌類成分[12]和二蒽酮類成分與其“瀉下攻積”功效相關(guān)，而酚酸類成分則與其“逐瘀通經(jīng)”功效相關(guān)[13]，因此，不同道地產(chǎn)區(qū)大黃在功效組分含量和比例上的差異，極有可能會導(dǎo)致其在不同功效上產(chǎn)生差異。照此推論，游離蒽醌類物質(zhì)含量最高的銓水大黃，其清熱解毒功效較強；蒽醌類成分和二蒽酮類成分含量最高的莊浪大黃，其瀉下作用可能最強；而酚酸類成分含量最高的涼黃，其抗凝血作用可能最強。

4.3 多道地產(chǎn)區(qū)并立的中藥材質(zhì)量評價宜按照功效組分分別評價

中藥材是一個多功效、多組分的復(fù)雜體系，因此，在中藥材質(zhì)量評價中應(yīng)該根據(jù)其不同功效，從不同功效組分維度分別評價。特別是對于多道地產(chǎn)區(qū)并立的藥材，極有可能是不同道地產(chǎn)區(qū)在不同功效上具有不同特長。本研究發(fā)現(xiàn)，不同道地產(chǎn)區(qū)大黃在不同功效組分含量和比例上存在豐富的分化，因此，在中醫(yī)今后用藥中可以按照功效需求，分別選擇不同道地產(chǎn)區(qū)的藥材，從而實現(xiàn)更為精確的對癥用藥，提高中藥療效。

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AnalysisonFunctionalComponentsContentofRadixetRhizomaRheiinDifferentGeo-authenticHabitat

LIU Jia1，LI Li2，3，HU Huijuan1，SHANG Tong1，MENG Lei1，LI Yongjie1，WEI Shengli1，4*

(1.SchoolofChinesePharmacy，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China；2.BeijingChineseMedicineHospitalaffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing100035，China；3.BeijingInstituteofChineseMedicine，Beijing100035，China；4.EngineeringResearchCenterofGoodAgriculturalPracticeforChineseCrudeDrugs，MinistryofEducation，Beijing100102，China)

Objective：To study the difference of contents and proportions of 4 kinds of functional components (free anthraquinones，combined anthraquinones，phenolic acids and bianthrone) in 14 kinds of active components of Radix et Rhizoma Rhei in 8 kinds of different geo-authentic habitat，evaluates indirectly the difference of “diarrhea under the plot，heat-clearing and detoxifying，by silt through” 3 functional activity.Methods：The contents of the components was determined by HPLC，variance was analyzed by SPSS.Results：Between different geo-authentic habitat of Radix et Rhizoma Rhei，4 kinds of functional components were all significantly different (P<0.05).Among them，the highest content of free anthraquinones was Quanshui Radix et Rhizoma Rhei，the second were Xining and Hezhou Radix et Rhizoma Rhei；the highest content of combined anthraquinones and bianthrone was Zhuanglang Radix et Rhizoma Rhei，the second were Xining and Ya Radix et Rhizoma Rhei；the highest content of phenolic acids was Liang Radix et Rhizoma Rhei，the second were Xining and Quanshui Radix et Rhizoma Rhei.Conclusion：Combining the pharmacological activity of different components，Quanshui，Xining and Hezhou Radix et Rhizoma Rhei could all be potential special medicinal germplasm that have function of active blood circulation to dissipate blood stasis；Zhuanglang，Xining and Ya Radix et Rhizoma Rhei could all be potential specialmedicinal germplasms that exist diarrhea attack characters；Xining，Quanshui and Liang Radix et Rhizoma Rhei could all be potential special medicinal germplasm that activate blood circulation to dissipate blood stasis.The above results are of great significance for the accurate use of Radix et Rhizoma Rhei.

Genuine medicinal materials；Radix et Rhizoma Rhei；active components；functional components

國家自然科學(xué)基金項目(31570331，31170307)；國家工信部項目(YC12TY-1QT0007)；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題(2016-JYB-XS071)

] 魏勝利，教授，研究方向：中藥資源定向培育及中藥資源綜合開發(fā)；Tel：(010)84738334，E-mail：wsl7491@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.014

2017-03-22)

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