史鑫波，唐偉博，白宏博，沈昕，唐寶全，楊春寧，孫曉春，唐志書，劉妍如*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712083；2.陜西省咸陽(yáng)市實(shí)驗(yàn)中學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712000)

·中藥工業(yè)·

不同加工方法對(duì)貫葉連翹中黃酮類成分的影響△

史鑫波1，唐偉博2，白宏博1，沈昕1，唐寶全2，楊春寧2，孫曉春1，唐志書1，劉妍如1*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712083；2.陜西省咸陽(yáng)市實(shí)驗(yàn)中學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712000)

目的：研究不同加工方法對(duì)貫葉連翹中5種主要黃酮類成分的影響及變化規(guī)律，以尋找適宜的干燥方法和條件。方法：貫葉連翹全草洗凈泥土，分別經(jīng)4、-20、-80 ℃儲(chǔ)存48 h后陰干，直接陰干和曬干方法進(jìn)行加工后，剪切后得到5組樣本。采用超高液相色譜(UPLC-PDA)測(cè)定貫葉連翹中5種主要的黃酮類成分含量。將5種不同加工方法處理樣品的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分分析法(PCA)綜合評(píng)價(jià)貫葉連翹經(jīng)不同加工方法處理后其中的黃酮類成分的含量變化規(guī)律，并對(duì)不同加工方法進(jìn)行多元比較。結(jié)果：經(jīng)UPLC分析，貫葉連翹5種黃酮類化合物均可在10 min內(nèi)出峰，且在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.999 1)，檢出限范圍為0.020～0.107 μg·mL-1，定量限范圍為0.133～0.667 μg·mL-1，平均加樣回收率為95.05%～102.47%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為0.13%～1.99%。PCA結(jié)果顯示，不同處理方法對(duì)貫葉連翹成分含量影響綜合評(píng)分依次為：曬干>-80 ℃>-20 ℃>陰干>4 ℃。結(jié)論：建立的UPLC方法快捷、靈敏、準(zhǔn)確，適用于5種主要黃酮類成分的同時(shí)測(cè)定。PCA結(jié)果說明，不同加工方法對(duì)貫葉連翹中黃酮類活性成分有一定影響，綜合主要成分的變化規(guī)律，選擇-20 ℃冷凍48 h后晾干作為優(yōu)化的加工方法。

貫葉連翹；藥材初加工；超高效液相色譜法；主成分分析；黃酮類

貫葉連翹HypericumperforatumL.為藤黃科金絲桃屬植物貫葉連翹的全草或帶根全草，又稱貫葉金絲桃、圣約翰草。味辛，性寒，歸肝經(jīng)，始載于《南京民間藥草》。《貴州草藥》有載：貫葉連翹能“清熱、解毒、通乳、利濕”，具有疏肝解郁、清熱、除濕、消腫通乳等功能[1]。研究顯示，貫葉連翹中的黃酮類化合物是其主要的活性成分和主要物效基礎(chǔ)之一，具有抗抑郁、抗焦慮、抗菌抗炎、調(diào)節(jié)更年期代謝紊亂等生物學(xué)功能[2-5]。

藥材的初加工技術(shù)具有悠久的應(yīng)用歷史和充分的中醫(yī)藥理論依據(jù)，不同方法加工的藥材在化學(xué)成分和含量方面具有明顯的差異，這也是導(dǎo)致同種藥材出現(xiàn)藥效不同的原因之一。隨著對(duì)中藥材加工技術(shù)、分析技術(shù)和數(shù)據(jù)處理技術(shù)的深入研究，其加工條件也得到不斷提高[6-8]。

1 儀器與材料

1.1儀器

WatersAcquityUPLC型超高效液相色譜儀，配備四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、PAD檢測(cè)器，以及Empower2工作站；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；十萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；GeneVacmiVac低溫離心濃縮儀。

1.2試藥

金絲桃苷、槲皮苷和蘆丁(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為111521-201406，111538-200504，10080-201408)；槲皮素、異槲皮素(寶雞市辰光生物科技有限公司，批號(hào)分別為6151-25-3，21637-25-2)；貫葉連翹藥材采自陜西太白山縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)、陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心劉世軍副教授鑒定為藤黃科植物貫葉連翹HypericumPerforatumL.的全草；實(shí)驗(yàn)用甲醇、乙腈均為色譜純；其余為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1方法學(xué)建立

2.1.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 分別取金絲桃苷、槲皮素、異槲皮素、槲皮苷、蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，置于10mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，再定容至刻度線，再取0.25mL置于5mL容量瓶中，加甲醇溶液制成金絲桃苷、槲皮素、異槲皮素、槲皮苷、蘆丁質(zhì)量濃度分別為142.50、133.75、151.25、127.50、122.50μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，于4℃保存，備用。

2.1.2供試品溶液的制備 精密稱取貫葉連翹不同干燥方法：4℃(4℃冷藏48h后晾干)、-20℃(-20℃冷凍48h后晾干)、-80℃(-80℃冷凍48h后晾干)、直接陰干、直接曬干的藥材粉末(過三號(hào)篩)各0.4g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50mL，稱定重量，加熱回流1h，靜置至室溫，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過0.22μm微孔有機(jī)濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，于4℃保存，備用。

2.1.3色譜條件 采用ACQUITYUPLC?BEHC18(50mm×2.1mm，1.7μm)色譜柱；流動(dòng)相A為水(含0.2%的甲酸)，B為乙腈，梯度洗脫，洗脫條件為：0～10min，2%～35%B；10～13min，35%B；13～14min，35%～2%B；14～16min，2%B；流速為0.2mL·min-1；進(jìn)樣量為2μL；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。

2.1.4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 按2.1.3項(xiàng)下設(shè)定色譜條件，將混合對(duì)照品溶液、供試品溶液分別進(jìn)樣2μL，進(jìn)行色譜分析。混合對(duì)照品溶液、各供試品溶液對(duì)比色譜圖見圖1。結(jié)果顯示，各成分分離度符合測(cè)定要求，且空白溶液在相應(yīng)位置未見干擾。

2.1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線 按2.1.3項(xiàng)下設(shè)定色譜條件，精密吸取2.1.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按6個(gè)梯度體積稀釋，同體積進(jìn)樣，進(jìn)樣量為2μL，進(jìn)行色譜分析，以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液中化合物質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各成分的回歸方程，結(jié)果見表1。

2.1.6定量限和檢出限 以空白樣品為檢測(cè)對(duì)象，添加不同體積的混合對(duì)照品溶液，按2.1.3項(xiàng)下設(shè)定色譜條件，進(jìn)樣量為2μL，以各對(duì)照品信噪比(S/N)10∶1為定量限(LOQ)，信噪比(S/N)3∶1為檢測(cè)限(LOD)，結(jié)果見表1。

2.1.7精密度試驗(yàn) 精密吸取2.1.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為2μL，測(cè)得金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷、異槲皮素各色譜的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為0.31%～0.91%，表明儀器精密度良好。

注：1.蘆丁(7.216 min)；2.金絲桃苷(7.346 min)；3.異槲皮素(7.448 min)；4.槲皮苷(8.122 min)；5.槲皮素(10.027 min)。圖1 不同加工方法貫葉連翹UPLC圖

成分線性范圍/μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)r最低檢測(cè)限LOD/μg·mL-1最低定量限LOQ/μg·mL-1槲皮素 1.07～22.29Y=13100X-101830.99980.1070.167蘆丁 3.83～122.50Y=7020X-15410.99980.0500.250金絲桃苷4.45～142.50Y=9070X-24860.99950.0570.133異槲皮素5.90～151.25Y=9080X-36140.99920.0670.200槲皮苷 1.05～21.25Y=61200X-47470.99910.0200.667

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下設(shè)定色譜條件，進(jìn)樣量為2 μL，測(cè)出金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷、異槲皮素各峰的峰面積，計(jì)算RSD值。不同處理方法下，5種黃酮類化合物的重復(fù)性RSD值為0.19%～1.86%，說明方法重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、24 h，按2.1.3項(xiàng)下設(shè)定色譜條件，進(jìn)樣量為2 μL，測(cè)定金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷、異槲皮素各峰的峰面積，計(jì)算RSD值，不同處理方法下，5種黃酮類化合物的重復(fù)性RSD值為0.24%～1.76%，表明樣品中各成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知不同加工方法處理的貫葉連翹黃酮類成分含量的藥材0.2 g，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密稱取金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷對(duì)照品適量，根據(jù)供試品中已知各成分含量的80%、100%、120%，加入上述供試品溶液中。按2.1.3項(xiàng)下設(shè)定色譜條件，進(jìn)樣量為2 μL，計(jì)算回收率和RSD值。5種黃酮類化合物的回收率為95.05%～102.47%，見表2。說明該方法回收率高，適用于貫葉連翹中黃酮類成分的測(cè)定要求。

表2 5種黃酮類成分的加樣回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3) %

表2(續(xù))

2.1.11 樣品含量測(cè)定 按2.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法，將不同加工的貫葉連翹分別平行制樣6份，0.22 μm有機(jī)微孔濾膜濾過，按2.1.3項(xiàng)下設(shè)定色譜條件，進(jìn)樣量2 μL，按外標(biāo)法計(jì)算各成分含量，見圖2。

圖2 不同加工方法貫葉連翹中5種黃酮類化合物的含量(n=6)

2.2 不同處理方法對(duì)貫葉連翹中黃酮類化合物的影響分析

對(duì)貫葉連翹不同加工方法測(cè)定的色譜數(shù)據(jù)(n=6)進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)齊、積分、標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用simca-p 13.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)。從得到的數(shù)據(jù)矩陣中提取攜帶差異變量最多的主成分，并將各成分作為觀測(cè)變量，分析變異最大的成分，最后找到因加工方法的不同而產(chǎn)生的差異成分信息[9-10]。

貫葉連翹不同加工方法得到的數(shù)據(jù)經(jīng)中心化處理后，進(jìn)行PCA模型擬合。由相關(guān)系數(shù)矩陣R得到特征值、方差貢獻(xiàn)率(R2X)和累計(jì)貢獻(xiàn)率(Q2cum)結(jié)果。系統(tǒng)根據(jù)交叉有效性指標(biāo)(>0.097 5)提取前3個(gè)主成分，正交驗(yàn)證值為87.3%，說明模型擬合良好(見表3)。通過各成分關(guān)系的載荷矩陣，可以找到造成兩組差異的成分信息(見表4)。由載荷計(jì)算回歸系數(shù)值，可以看出造成兩組差異的成分峰(保留時(shí)間)主要為7.269、7.415、7.29、7.533、7.507、7.404、7.436、4.964、5.462、7.144、10.126 min處。根據(jù)色譜行為鑒定出咖啡酸、綠原酸、異槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷。其中，異槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷的峰與第一主成分高度正相關(guān)，咖啡酸和綠原酸的色譜峰信息與第二主成分正相關(guān)。根據(jù)PCA載荷圖，從不同加工樣本的UPLC指紋圖譜保留時(shí)間及對(duì)應(yīng)的峰面積得到差異成分的相關(guān)信息結(jié)果。從中指認(rèn)了3個(gè)特征峰，分別為蘆丁(7.144 min)、金絲桃苷(7.269 min)和異槲皮素(7.436 min)。說明第一主成分主要包括了黃酮類的主要差異信息。

表3 主成分特征值及累積貢獻(xiàn)率表

表4 差異成分載荷指標(biāo)

計(jì)算得到5種加工方法得分值分別為：F4℃=-551.512、F-20℃=-151.974、F-80℃=439.425、F陰干=-368.874、F曬干=779.409 7。由結(jié)果可知，曬干加工得分最高，-80 ℃冷凍48 h后晾干加工得分次之，但結(jié)合各成分含量測(cè)定結(jié)果，-80 ℃、曬干和陰干加工后貫葉連翹樣品無(wú)法檢測(cè)到槲皮苷的含量。因此，綜合含量測(cè)定和主成分分析結(jié)果得到貫葉連翹加工的方法以-20 ℃冷凍48 h后晾干為宜，其次為4 ℃冷藏48 h后晾干。

3 討論

貫葉連翹是臨床治療抑郁癥、阿爾茲海默癥、更年期綜合征的有效藥材，不論其提取物還是活性成分提取物都具有良好的藥理活性?，F(xiàn)代研究報(bào)道，貫葉連翹的加工方法主要為室溫避光陰干、60～100 ℃烘干等，這些加工方法對(duì)貫葉連翹藥材質(zhì)量影響較大，其中60 ℃烘干的貫葉連翹中蘆丁和金絲桃苷含量最高，并在一定溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)先高后低的含量變化。但是，鮮有文獻(xiàn)對(duì)其加工的方法進(jìn)行優(yōu)化和探索，或者采用的檢測(cè)指標(biāo)暫無(wú)法充分反映加工方法對(duì)主要成分的影響[11-12]。

本文借助超高效液相色譜技術(shù)，建立了貫葉連翹藥材經(jīng)不同干燥方法處理后黃酮類化合物的UPLC測(cè)定方法，采用主成分分析法分析不同溫度加工處理對(duì)貫葉連翹中多個(gè)黃酮類成分的影響規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貫葉連翹加工的方法以-20 ℃冷凍48 h后晾干的綜合得分最好，其次為4 ℃冷藏48 h后晾干，這與傳統(tǒng)的加工方式不同。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，溫度是對(duì)黃酮類含量影響最大的因素，從結(jié)果來看，呈現(xiàn)非線性的變化趨勢(shì)，這與以往的研究報(bào)道一致。進(jìn)一步說明，在儲(chǔ)存干燥過程還應(yīng)該考慮到光照、濕度等因素的影響。

4 結(jié)論

綜合研究結(jié)果表明，通過對(duì)貫葉連翹不同加工方法的優(yōu)化，可以提升貫葉連翹干燥效率，保證活性成分含量，為有效地控制貫葉連翹內(nèi)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

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EffectofDifferentProcessingApproachesonFlavonoidsinHypericumperformatum

SHI Xinbo1，TANG Weibo2，BAI Hongbo1，SHEN Xin1，TANG Baoquan2，YANG Chunning2，SUN Xiaochun1，TANG Zhishu1，LIU Yanru1*

(1.ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，ShaanxiprovincekeylaboratoryofnewdrugsandChinesemedicinefoundationresearch，ShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang,712083，Shaanxi，China；2.XianyangShiyanMiddleSchool，Xianyang,712000，Shaanxi，China)

Objective：To study the main effect of different processing approach on five flavonoids fromHypericumperformatumfor providing suitable drying methods.Methods：The whole plants ofH.performatumwere cleaned and divided into five processing groups：4 ℃，-20 ℃，-80 ℃，shade and sun drying.An ultra-performance liquid chromatography (UPLC) method was adopted to determine the content of 5 flavonoids.The collect data were standardized and principal component analysis (PCA) was performed on the five processing groups data for differentiation analysis.Results：By using the optimized UPLC method，all the compounds eluted within 10 min.The correlation coefficients (r) were greater than 0.9991 in the linear ranges of the 5 compounds.The limits of detection (LODs) were 0.020-0.107 μg·mL-1，the limits of quantitation (LOQs) were 0.133-0.667 μg·mL-1，the recoveries were between 95.05 % to 102.47 % at three spiked levels with the relative standard deviations (RSD，n=3) ranging 0.13%-1.99%.Based on the PCA results，the integral scores of 5 flavonoids fromH.performatumwith various processing approach in the order from high to low，sun-drying >-80 ℃>-20 ℃>shade drying>4 ℃.Conclusion：The established UPLC method is sensitive，accurate and efficient，which suitable for 5 flavonoids ofH.performatumsimultaneous determination.Meanwhile，the PCA results indicated that different processing method have certain impacts onH.performatumflavonoids contents.Then，the processing method of -20 ℃ storage-shade drying is considered as the better method.

Hypericumperformatum；herbal medicine pre-processing；UPLC；PCA；flavonoids

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81501229)；陜西省教育廳專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(320104-203010012)；陜西省教育廳“春筍計(jì)劃”項(xiàng)目(2011K16-03-02)

] 劉妍如，講師，研究方向：藥物分析；Tel：(029)38182207，E-mail：yanzi_2203@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.025

2017-02-24)

*[