黨珍，張艷萍，王西芳*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.安康市中醫(yī)院，陜西 安康 725000)

·基礎(chǔ)研究·

子洲黃芩中黃酮成分的含量測定及指紋圖譜研究△

黨珍1，張艷萍2，王西芳1*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.安康市中醫(yī)院，陜西 安康 725000)

目的：比較分析陜西子洲與其他產(chǎn)區(qū)黃芩中黃酮成分的含量并建立其HPLC指紋圖譜，為子洲黃芩的質(zhì)量評價(jià)及道地藥材品牌建設(shè)提供資料。方法：采用HPLC測定樣本中不同產(chǎn)區(qū)的黃芩所含黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素3個(gè)主要黃酮成分的含量。色譜條件：Eclipse-YDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液系統(tǒng)，梯度洗脫；體積流量為1.0 mL·min-1；檢測波長為277 nm；柱溫為30 ℃。結(jié)果：子洲黃芩中黃芩苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.3%，明顯高于樣本包含的其他產(chǎn)地的黃芩；以黃芩苷峰為參照物峰，確定11個(gè)共有峰，建立了子洲黃芩HPLC指紋圖譜共有模式方法。結(jié)論：陜西子洲黃芩有效成分含量高，品質(zhì)優(yōu)；建立的HPLC指紋圖譜可以作為分析和控制子洲黃芩質(zhì)量的基礎(chǔ)資料。子洲作為黃芩道地藥材產(chǎn)區(qū)發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

子洲黃芩；HPLC指紋圖譜；黃芩苷；品質(zhì)質(zhì)量

黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效[1-2]。研究顯示，黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等黃酮類化合物為黃芩的主要有效成分[3-6]，具有解熱抗炎、抗腫瘤、解毒、保肝及調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[7-9]。黃芩為我國傳統(tǒng)常用中藥，主產(chǎn)于陜西、甘肅、山西、河北、山東、河南等地；陜西子洲縣位于陜西北部黃土高原丘陵溝壑區(qū)的腹地，是古代陜西黃芩的道地產(chǎn)區(qū)之一[2]，子洲黃芩有40余年的栽培歷史，藥材以其條長、質(zhì)實(shí)、色黃的優(yōu)良性狀享譽(yù)省內(nèi)外，現(xiàn)已成為該縣中藥材產(chǎn)業(yè)的主要經(jīng)濟(jì)支柱。有關(guān)子洲黃芩品質(zhì)質(zhì)量分析與研究，目前尚未見有報(bào)道，本文以黃芩中黃酮類為質(zhì)量指標(biāo)性成分，比較分析子洲與其他不同產(chǎn)區(qū)黃芩中黃酮成分的含量，建立HPLC指紋圖譜，為子洲黃芩的品質(zhì)質(zhì)量評價(jià)及道地藥材品牌建設(shè)提供基礎(chǔ)資料。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260系列高效液相色譜儀及其工作站；GB204型十萬分之一電子天平(梅特勒電子天平)；KQ-200KDE型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；優(yōu)普系列超純水機(jī)UPT-Ⅱ(成都超純水科技有限公司)。

1.2 試藥

黃芩素對照品(批號：111595-201306)、黃芩苷對照品(批號：110715-201117)和漢黃芩素對照品(批號：111514-200403)，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 黃芩藥材

收集黃芩樣品24批，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室王西芳教授鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》2015版黃芩藥材標(biāo)準(zhǔn)，樣品來源的詳細(xì)情況見表1。甲醇、乙醇、乙腈、甲酸、磷酸均為色譜純，水為超純水。其他試劑均為分析純。

表1 黃芩樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Eclipse-YDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5m)；流動相為甲醇(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫；程序：0～10 min，30%～40%A；10～20 min，40%～50%A；20～30min，50%～50%A；30～40 min，50%～60%A；40～50 min，60%～70%A；50～60 min，70%～30%A；檢測波長：277 nm；體積流量：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10L。

2.2 對照品溶液的制備

分別取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品6.20、3.00、3.00 mg，精密稱定，加入10 mL容量瓶內(nèi)，甲醇超聲使溶解，并用甲醇稀釋至刻度，然后分別移取定容好的溶液5、2、1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成含黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素分別為 62、12、6 μg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。HPLC圖見圖1。

2.3 供試品溶液制備

取0.2 g黃芩藥材粉末，精密稱定，置 50 mL量瓶中，加70%乙醇水溶液40 mL超聲提取40 min，放置至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45m微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。HPLC圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.供試品。圖 1 混合對照溶液和黃芩供試溶液HPLC圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取上述黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素混合對照品溶液，按2.1色譜條件分別進(jìn)樣3、5、10、15、20、25、30L測定峰面積值。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，得黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素回歸方程，分別為：Y=2 614.3X+14.318，r=1；Y=4 031.4X+4.746 8，r=1；Y=4 980.7X+4.927 9，r=0.999 8；黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素線性范圍分別為：0.186～1.860g、0.036～0.360g、0.0186～0.186g。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1號供試品溶液，按2.1方法分別在0、2、4、6、8、12、24 h測定黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的峰面積。在24 h內(nèi)其RSD 值分別為1.5%、1.9%、1.8%，說明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1號樣品粉末6份，根據(jù)2.3方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下方法，測定黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的峰面積，RSD值分別為1.5%、1.5%、2.0%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的S1號黃芩樣品6份，每份0.1 g，精密稱定，按2.3方法制備溶液，精密吸取2 mL于10 mL量瓶中，分別精密加入對照品溶液(黃芩苷730 g·mL-1、黃芩素48 g·mL-1、漢黃芩素12 g·mL-1)各1 mL，用甲醇定容。按2.1方法測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 黃芩中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4.6 樣品含量測定 每個(gè)批次的藥材樣品按2.3方法平行制備3份，按2.1方法測定黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的峰面積，用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中3個(gè)成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 黃芩中3種黃酮類成分的含量測定結(jié)果

2.5 指紋圖譜研究

2.5.1方法學(xué)考察

2.5.1.1 內(nèi)參照峰的選擇 按2.1色譜條件，分別注入黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品10L，測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩苷出峰時(shí)間適中、峰明顯高，而且分離度比較好，故選擇黃芩苷作為內(nèi)參照峰。

2.5.1.2 精密度試驗(yàn) 按2.4.2所記錄的色譜圖上黃芩苷的色譜峰為內(nèi)參照峰，比較各主要色譜峰的相對保留時(shí)間和峰面積在5%以上峰的相對峰面積，RSD分別在0.2%～1.45%和1.02%～1.80%，符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。

2.5.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.4.3所記錄的色譜圖上黃芩苷的色譜峰為內(nèi)參照峰，比較各主要色譜峰的相對保留時(shí)間和峰面積在5%以上峰的相對峰面積，RSD值分別在0.1%～0.9%和0.75%～1.78%，該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。

2.5.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.4.4所記錄的色譜圖上黃芩苷的色譜峰為內(nèi)參照峰，比較各主要色譜峰的相對保留時(shí)間和峰面積在5%以上峰的相對峰面積，RSD值分別在0.1%～1.0%和0.83%～1.91%，表明該方法穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。

2.6 子洲黃芩指紋圖譜的建立

將子洲的10個(gè)批次的黃芩樣品，按2.3方法進(jìn)行制備，按2.1條件測定并記錄60 min色譜圖，按照指紋圖譜研究技術(shù)的要求，建立子洲產(chǎn)黃芩的指紋圖譜。將黃芩苷的峰作為內(nèi)參比峰，對各色譜峰的相對保留時(shí)間進(jìn)行分析，從共有峰中選取穩(wěn)定性好、峰面積大、特征明顯的色譜峰作為特征峰。選取了其中11個(gè)色譜峰為特征峰，并計(jì)算各個(gè)共有峰相當(dāng)于內(nèi)參比峰的峰面積比值，通過和對照品的保留時(shí)間進(jìn)行比較，并結(jié)合文獻(xiàn)資料，指認(rèn)了其中的6個(gè)峰，其中3為野黃芩苷、4為黃芩苷、7為漢黃芩苷、8為黃芩素、10為漢黃芩素、11為千層紙素，結(jié)果見圖2、表4、表5，各樣品的非共有峰面積與總峰面積的比值均小于10%，符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。

2.7 相似度分析

運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版，進(jìn)行相似度評價(jià)[10-11]。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入該軟件，

選定參照譜圖，設(shè)定成中位數(shù)匹配模式，進(jìn)行多點(diǎn)校正后自動匹配，然后軟件會自動生成對照譜峰R，見圖3，相似度計(jì)算結(jié)果見表6，相似度在0.994以上，相似度較高。

圖2 子洲黃芩指紋圖譜共有峰

峰號S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10平均值RSD(%)10.3020.3030.3020.3010.3010.3030.3020.3030.3020.3000.3020.3320.5780.5750.5800.5800.5800.5810.5810.5820.5790.5750.5790.4230.6890.6860.6910.6910.7110.6910.6920.6920.6900.6860.6920.9741.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0051.1391.1401.1401.1401.1401.1391.1371.1381.1431.1411.1400.1461.2491.2511.2541.2531.2521.2491.2451.2471.2561.2541.2510.2871.3051.2971.3011.3001.2991.2951.2901.2931.3031.3011.2980.3681.7241.7291.7281.7281.7271.7251.7231.7321.7361.7301.7280.2291.9751.9751.9711.9721.9721.9761.9741.9711.9861.9781.9750.23102.1052.1072.0992.0992.1012.1092.1062.1062.1162.1062.1050.24112.2182.2182.2092.2112.2122.2202.2172.2182.2292.2192.2170.25

表5 子洲黃芩指紋圖譜共有峰相對峰面積

表6 黃芩藥材相似度計(jì)算結(jié)果

注：R.對照指紋圖譜。圖3 10批子洲產(chǎn)黃芩藥材的指紋圖譜

3 結(jié)論與討論

子洲黃芩的黃芩苷含量范圍為：18.1%～20.8%，黃芩苷含量明顯較高(《中華人民共和國藥典》規(guī)定黃芩苷含量不得低于8%)；其中黃芩素、漢黃芩素的含量范圍為：0.7%～1.7%，0.2%～0.4%，與其他產(chǎn)地樣品比較沒有明顯差異。以黃芩苷含量為評價(jià)指標(biāo)，子洲產(chǎn)黃芩的質(zhì)量明顯優(yōu)于其他產(chǎn)地，子洲產(chǎn)黃芩具有很大的發(fā)展?jié)摿?。但單一成分并不能全面評價(jià)黃芩的品質(zhì)，HPLC指紋圖譜比較全面地反映了藥材所含化學(xué)成分的數(shù)與量關(guān)系，可以更加有效地評價(jià)藥材的內(nèi)在質(zhì)量。用子洲產(chǎn)10個(gè)批次的黃芩藥材的HPLC色譜圖建立了子洲產(chǎn)黃芩的指紋圖譜共有模式，分析各指紋圖譜發(fā)現(xiàn)存在一定差異，但均有相同的特征峰，而且分離效果都比較好，保留時(shí)間也相對穩(wěn)定，該方法建立的指紋圖譜可用于子洲產(chǎn)黃芩的質(zhì)量評價(jià)，對子洲黃芩的品牌建設(shè)與產(chǎn)業(yè)發(fā)展有一定的指導(dǎo)意義。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：301-302.

[2] 李欣，黃璐琦，邵愛娟，等.黃芩種質(zhì)資源的研究概況[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2003，5(6)：54-58.

[3] 金敏.黃芩中黃酮類化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2009，9(9)：55-56.

[4] 楊立新，劉岱，馮學(xué)峰，等.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地黃芩中黃酮化合物的含量[J].中國中藥雜志，2008，27(3)：166.

[5] 田建紅.不同產(chǎn)地黃芩中的有效成份含量分析[J].海峽藥學(xué)，2009，21(3)：57-59.

[6] 常小平，王影.不同產(chǎn)地黃芩中主要有效成分含量比較[J].河南中醫(yī)，2010，30(12)：1176.

[7] 張瑜，武斌，許建衛(wèi).黃芩藥理作用的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2013，19(6)：1091-1093.

[8] 鄭勇鳳，王佳婧，傅超美，等.黃芩的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中成藥，2016，38(1)：141-147.

[9] 辛文妤，宋俊科，何國榮，等.黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志，2013，22(6)：647-653.

[10] 肖蓉, 張志斐, 袁志芳,等. 河北道地藥材黃芩指紋圖譜的研究[J]. 藥物分析雜志, 2007，27(7):1018-1023.

[11] 薛黎明，秦雪梅，張麗增.不同產(chǎn)地黃芩藥材的黃芩苷含量測定及指紋圖譜研究[J].中成藥，2008，30(1)：11.

DeterminationofFlavonoidsandFingerprintsofScutellariabaicalensisfromZizhou

DANGZhen1，ZHANGYanping2，WANGXifang1*

(1.ShaanxiUniversityofChinesemedicine，Xianyang712046，China；2.AnkangHospitalofTraditionalChineseMedicine，Ankang725000，China)

Objective：To compare the contents of flavonoids inScutellariabaicalensisfrom Zizhou and other areas，and establish the HPLC fingerprint of ZizhouS.baicalensisaimed at providing references for the quality evaluation and pharmaceutical raw materials.Methods：Baicalin，baicalein and wogonin were determined by HPLC，and Eclipse-YDB-C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)were used with methanol(B)and 0.2% phosphoric acid solution(A)in gradient elution mode at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 277 nm and the column was 30 ℃.Results：The average content of baicalin in ZizhouS.baicalensiwas 19.3%，significantly higher than those of the other samples.11 common peaks were identified by using the baicalin peak as the reference，established the HPLC fingerprints of ZizhouS.baicalensitotal pattern method was establsied.Conclusion：ZizhouS.baicalensihas a high content of effective ingredients，good quality.HPLC fingerprint can be applied for analyzing and controlling the quality of ZizhouS.baicalensi.As the typicalScutellariaproducing region，Zizhou has a great potential for further development.

Scutellariabaicalensisfrom Zizhou；HPLC fingerprint；biaealin；quality

陜西省教育廳基金項(xiàng)目(Z54)

] 王西芳，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥資源的開發(fā)利用；E-mail：wangxifang@vip.sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.008

2016-07-28)

*[