石成方，劉暢，楊蓉婭

(陸軍總醫(yī)院 全軍皮膚損傷修復(fù)研究所，北京 100125)

·基礎(chǔ)研究·

云苓在色素沉著性皮膚病中的應(yīng)用研究

石成方，劉暢，楊蓉婭*

(陸軍總醫(yī)院 全軍皮膚損傷修復(fù)研究所，北京 100125)

目的：探討中藥茯苓在皮膚科中的應(yīng)用價(jià)值。方法：通過黑色素生成反應(yīng)過程中的酶活抑制實(shí)驗(yàn)，以氫醌和維生素C為陽性對(duì)照，研究茯苓三萜粗提物、萃取物、純化組分對(duì)黑色素合成關(guān)鍵酶的影響。結(jié)果：茯苓三萜粗提物對(duì)酪氨酸酶的最高抑制率僅為90.3%，氫醌和Vc陽性對(duì)照品在任何樣品濃度范圍內(nèi)的抑制率均高于茯苓三萜粗提物；茯苓三萜三氯甲烷萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率高達(dá)188.3%，高于正丁醇萃取物(85.3%)及乙酸乙酯萃取物(83.7%)，氫醌和Vc對(duì)酪氨酸酶的抑制率分別在樣品濃度≥2 mg·mL-1、≥3 mg·mL-1時(shí)均低于茯苓三萜三氯甲烷萃取物；茯苓三萜純化組分③對(duì)酪氨酸酶的抑制率高達(dá)223.5%，高于純化組分①(81.5%)及純化組分②(201.8%)，氫醌和Vc對(duì)酪氨酸酶的抑制率在樣品濃度>2 mg·mL-1時(shí)低于茯苓三萜純化組分③。結(jié)論：茯苓三萜三氯甲烷萃取物及其純化組分具有強(qiáng)勁的酪氨酸酶抑制作用，能有效調(diào)控黑色素生成，適宜開發(fā)治療黃褐斑、雀斑等色素沉著性皮膚病的祛斑美白產(chǎn)品。

茯苓；黑色素；酪氨酸酶；祛斑；美白

隨著人們生活品質(zhì)的提高，現(xiàn)代女性越來越追求水嫩透白的如雪肌膚。然而，人表皮基底層分布的黑色素過量表達(dá)時(shí)[1]，可使膚色變黝黑，或可能導(dǎo)致黃褐斑、雀斑等人體色素沉著性皮膚病。目前，市場(chǎng)上流行千白氫醌乳膏、維生素C(Vc)美白霜和熊果苷祛斑霜等利用抑制酪氨酸酶活性原理研制的藥妝品，其主要通過產(chǎn)品內(nèi)含的中草藥提取物干擾黑色素合成[2]、緩解色素沉著而發(fā)揮美白作用。茯苓是一味記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》的上品中藥[3]，有利水消腫、寧心養(yǎng)神、健脾養(yǎng)胃等功效，強(qiáng)調(diào)內(nèi)服用藥有諸多益處。然而，目前關(guān)于茯苓外用的研究較少，尤其是對(duì)茯苓皮提取物的臨床應(yīng)用方面鮮有報(bào)道。本研究通過黑色素生成反應(yīng)過程中的酶活抑制實(shí)驗(yàn)，探討茯苓皮相關(guān)成分在皮膚科應(yīng)用中的潛在價(jià)值，為進(jìn)一步研究和開發(fā)治療色素沉著性皮膚病的藥妝品提供參考。

1 材料與儀器

1.1材料

實(shí)驗(yàn)用中藥為產(chǎn)于云南榕豐縣的茯苓干燥外皮，購于河北安國藥材交易市場(chǎng)，并且經(jīng)本院中醫(yī)科李伯教授鑒定為茯苓的干燥外皮。

蘑菇酪氨酸酶(批號(hào)：T3824-25KU)、L-多巴胺(批號(hào)：333786-250MG)均購于美國Sigma化學(xué)公司；氫醌、Vc(山東省德州市富凱化工有限責(zé)任公司)；其他試劑均為市售國產(chǎn)分析純，甲醇、正丁醇和乙酸乙酯(北京瑞福偉達(dá)化工有限公司)，三氯甲烷、二甲亞砜、磷酸二氫鉀和氫氧化鈉(天津化學(xué)試劑三廠)。

1.2主要試劑及儀器

FA2004B分析天平(上海平軒科學(xué)儀器有限公司)；DS-1電動(dòng)高速組織搗碎機(jī)(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；HH-6恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；SP-756P紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。

2 方法

2.1藥材的提取、分離和純化

茯苓三萜粗提物：干燥的茯苓皮藥材用組織搗碎機(jī)粉碎，研磨成粉末，過60目篩，精確稱取茯苓皮粉末10g。在70℃的條件下采用200mL甲醇水浴回流提取6h，重復(fù)提取2次，合并濾液，再經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮，低溫烘干，收集茯苓三萜粗提物，備用。

茯苓三萜萃取物：將茯苓三萜粗提物混散于水中，然后用正丁醇、乙酸乙酯和三氯甲烷萃取，旋干萃取液，收集茯苓三萜萃取物備用。

茯苓三萜純化組分：3種茯苓三萜萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離和液相檢測(cè)，得到洗脫液3份，并將其旋轉(zhuǎn)濃縮蒸干，最終收集3種純化組分①、②、③備用。

2.2樣品液的制備

茯苓三萜粗提取物用二甲亞砜溶解，配制質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8mg·mL-1的樣品液，備用；茯苓三萜正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物及三氯甲烷萃取物依次用二甲亞砜溶解，配制質(zhì)量濃度為1、2、3、4mg·mL-1的樣品液，備用；茯苓三萜純化組分①、②、③分別用二甲亞砜溶解，依次配制質(zhì)量濃度為1、2、3、4mg·mL-1的樣品液，備用。

酪氨酸酶溶液的配制：先分別取濃度為0.2mol·L-1的磷酸二氫鉀及氫氧化鈉溶液250、118mL，加水稀釋，配制成pH6.8的磷酸緩沖液，再用磷酸緩沖液配制酪氨酸酶溶液(10kU·L-1)。陽性對(duì)照品的氫醌用二甲亞砜配制，Vc則用純凈水配制。

2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

選用L-多巴胺作底物，酪氨酸酶作催化劑進(jìn)行黑色素生成反應(yīng)，反應(yīng)中加入不同濃度的樣品溶液，采用紫外分光光度計(jì)(475nm)測(cè)定吸光度(A)，按公式(1)計(jì)算抑制率，評(píng)估其對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，若未添加用(-)表示，添加用(+)表示。

抑制率(%)=[(A1-A2)-(A3-A4)]/
(A1-A2)×100%

(1)

式中：A1為中藥樣品(-)、酪氨酸酶溶液(+)的吸光度；

A2為中藥樣品(-)、酪氨酸酶溶液(-)的吸光度；

A3為中藥樣品(+)、酪氨酸酶溶液(+)的吸光度；

A4為中藥樣品(+)、酪氨酸酶溶液(-)的吸光度。

3 結(jié)果

3.1茯苓三萜的粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

隨著樣品濃度的增大，茯苓三萜粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用逐漸增強(qiáng)，其抑制率不斷攀升；當(dāng)樣品濃度增加至6mg·mL-1時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，其抑制率隨樣品濃度的增大而急驟下降。茯苓三萜粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制率最高達(dá)90.3%，低于氫醌(131.5%)和Vc(124.8%)，兩種陽性對(duì)照品在任何樣品質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的抑制率均高于茯苓三萜粗提物，見圖1。

圖1 茯苓三萜粗提物、氫醌與Vc對(duì)酪氨酸酶的抑制作用比較

3.2茯苓三萜的萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

當(dāng)樣品濃度范圍在1～2mg·mL-1時(shí)，氫醌、正丁醇及乙酸乙酯萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率不斷降低，Vc、三氯甲烷萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率逐漸升高；當(dāng)樣品濃度范圍在2～3mg·mL-1時(shí)，氫醌及3種萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率均升高，僅Vc對(duì)酪氨酸酶的抑制率下降；當(dāng)樣品濃度范圍3～4mg·mL-1時(shí)，氫醌對(duì)酪氨酸酶的抑制率繼續(xù)升高，Vc對(duì)酪氨酸酶的抑制率則繼續(xù)下降，3種萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率反轉(zhuǎn)下降。三氯甲烷萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率最高可達(dá)188.3%，而且能在較高的樣品濃度范圍內(nèi)仍維持較高水平(>100%)，其抑制率均高于氫醌、Vc、正丁醇及乙酸乙酯萃取物。見圖2和圖3。

圖2 茯苓三萜萃取物與氫醌對(duì)酪氨酸酶的抑制作用比較

圖3 茯苓三萜萃取物與Vc對(duì)酪氨酸酶的抑制作用比較

3.3茯苓三萜的純化組分對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

隨著樣品濃度的增大，茯苓三萜的純化組分①、②對(duì)酪氨酸酶的抑制率逐漸降低，尤其是純化組分②對(duì)酪氨酸酶的抑制率在樣品質(zhì)量濃度為2～3mg·mL-1時(shí)迅速下降；氫醌、Vc以及純化組分③在任何樣品濃度范圍內(nèi)均維持較高水平(>100%)，氫醌、Vc對(duì)酪氨酸酶的抑制作用較平穩(wěn)，純化組分③對(duì)酪氨酸酶的抑制率在樣品濃度為2～3mg·mL-1時(shí)逐漸升高，最高達(dá)223.5%，其抑制率均高于氫醌、Vc、純化組分①和②。見圖4和圖5。

圖4 茯苓三萜純化組分與氫醌對(duì)酪氨酸酶的抑制作用比較

圖5 茯苓三萜純化組分與Vc對(duì)酪氨酸酶的抑制作用比較

4 討論

黑色素細(xì)胞是分布于人體表皮基層的特殊細(xì)胞，其產(chǎn)生的黑色素通過減輕日光輻射發(fā)揮對(duì)細(xì)胞染色體的保護(hù)作用。如果黑色素生成不足，可能會(huì)引起白癜風(fēng)、白化病等色素障礙性皮膚病；如果黑色素過量沉積，易導(dǎo)致黃褐斑、雀斑和老人斑等色素沉著性皮膚病[4]。由于黑色素細(xì)胞以酪氨酸為原料，通過酪氨酸酶的催化作用，逐步氧化成黑色素。因此，黑色素生成多少很大程度上取決于合成關(guān)鍵酶——酪氨酸酶的活性。目前，市面上人工合成的氫醌和汞鹽等皮膚美白劑都是通過干擾黑色素生成，以達(dá)到快速亮膚美白的效果。但是，長期使用會(huì)對(duì)皮膚產(chǎn)生較大的毒副作用，可能會(huì)造成永久性脫色[5]。隨著中醫(yī)藥學(xué)的研究進(jìn)展，人們回歸自然、崇尚中草藥的思想不斷深化，從植物中提取活性成分研制的藥妝品應(yīng)用于皮膚保養(yǎng)越來越受到大家的歡迎和喜愛，例如從人參、熊果或厚葉巖白菜等提取的熊果苷對(duì)酪氨酸酶有抑制作用[6]，通過阻斷黑色素合成通路減少黑素形成，還可通過新陳代謝作用協(xié)同Vc等物質(zhì)參與色素代謝，淡化黑色素沉著，于是催生了熊果苷祛斑霜、Vc美白霜等產(chǎn)品。在當(dāng)今美容科學(xué)領(lǐng)域和藥品、化妝品行業(yè)中，利用天然藥物的開發(fā)技術(shù)探索中草藥的美白護(hù)膚價(jià)值已成為一個(gè)新研究熱點(diǎn)。

《本草綱目》記載：“面鼾雀斑。白茯苓末，蜜和，夜夜傅之，二七日愈”，詮釋白茯苓外敷能夠改善面部雀斑[7]。本研究以氫醌和Vc為陽性對(duì)照，通過黑色素生成反應(yīng)中的酶活抑制實(shí)驗(yàn)，分析茯苓的亮膚美白機(jī)制，為中西醫(yī)結(jié)合治療色素沉著性皮膚病提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：茯苓三萜粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用在樣品質(zhì)量濃度為6mg·mL-1時(shí)最強(qiáng)，其抑制率呈一個(gè)倒V字型，太低濃度或過高濃度的酶活抑制作用均不明顯，且均低于氫醌和Vc陽性對(duì)照品的酶活抑制率。茯苓三萜乙酸乙酯萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用在樣品質(zhì)量濃度為1mg·mL-1時(shí)最強(qiáng)，其抑制率高于正丁醇、三氯甲烷萃取物和氫醌、Vc陽性對(duì)照，但其抑制率隨樣品質(zhì)量濃度的增加而不斷下降；茯苓三萜三氯甲烷萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用在樣品質(zhì)量濃度為3mg·mL-1時(shí)最強(qiáng)，其抑制率高于正丁醇、乙酸乙酯萃取物和氫醌、Vc陽性對(duì)照，且其抑制率在高樣品濃度范圍內(nèi)維持較高水平；此外，茯苓三萜乙酸乙酯萃取物和三氯甲烷萃取物的純化組分對(duì)酪氨酸酶的抑制作用也如以上規(guī)律變化，各種萃取物對(duì)應(yīng)的純化組分對(duì)酪氨酸酶的抑制率均高于萃取物本身，尤其是三氯甲烷萃取物的純化組分表現(xiàn)出最強(qiáng)的酶活抑制作用。

綜上所述，中藥茯苓內(nèi)含豐富的藥用化學(xué)成分[8]，除了有已報(bào)道的利水滲濕、健胃養(yǎng)脾、抑菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力等活性外，還具有良好的美白護(hù)膚作用[9]，其三萜有效成分可通過抑制黑色素形成關(guān)鍵酶的活性，減少黑色素合成，從而達(dá)到美白效果。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，中藥茯苓三萜的低濃度乙酸乙酯萃取物及其純化組分和高濃度三氯甲烷萃取物及其純化組分對(duì)黑色素生成反應(yīng)過程中的酶活抑制作用突出，適宜深入研究和開發(fā)治療色素沉著性皮膚病的藥妝品，以此拓寬中藥茯苓的美容應(yīng)用途徑，創(chuàng)造更高的藥用附加值。

[1] 趙光.黑色素細(xì)胞的研究近況[J].西南軍醫(yī)，2013，15(2)：177-181.

[2] 王玉林，何錦風(fēng)，王維民.皮膚黑色素的產(chǎn)生及美白淺析[J].日用化學(xué)品科學(xué)，2013，36(2)：33-49.

[3] 沈玉萍，李軍，賈曉斌.中藥茯苓化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28(3)：297-300.

[4] 李承新，王玲.皮膚色素沉著發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2009，18(9)：1372-1375.

[5] 周意，陳祖輝，梁豐，等.藥妝品在我國的發(fā)展歷史、研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景[J].中國藥房，2013，24(27)：2578-2580.

[6] 李溯，丁勁松.黑色素生物合成與酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2013，11(4)：278-281.

[7] 鹿繁修.外用美白中藥的應(yīng)用研究近況[J].中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生，2014，2(1)：165-167.

[8] 游昕，熊大國，郭志斌，等.茯苓多種化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015,43(2)：106-109.

[9] 常富業(yè).茯苓抗衰、養(yǎng)生與美容作用詮析[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29(5)：1107-1110.

Study on Application ofPoriacocosfor Treatment of Patients with Dark Skin Pigmentation

SHI Chengfang，LIU Chang，YANG Rongya*

(Institute of Skin Injury and Repair，People’s Liberation Army General Hospital，Beijing 100125，China)

Objective：To investigate the clinical value ofPoriacocosin dermatology.Methods：The tyrosinase activity inhibition rate ofP.cocostriterpene crude extract，extract and purified fraction were measured by tyrosinase activity inhibition experiments in the process of melanin formation reaction，and the hydroquinone and Vc were selected as the positive controls.Results：The highest tyrosinase activity inhibition rate was 90.3% inP.cocostriterpene crude extract group，its tyrosinase activity inhibition rate was significantly lower than that of hydroquinone and Vc positive control group.The highest tyrosinase activity inhibition rate was 188.3% in chloroform extracts group，it was significantly higher than that of the n-butanol extracts group (85.3%) and the ethyl acetate extracts group (83.7%)，the tyrosinase activity inhibition rate in the hydroquinone and Vc positive control group were significantly lower than that the chloroform extracts group until the sample concentration was increased to ≥ 2 mg·mL-1and ≥ 3 mg·mL-1individually，the highest tyrosinase activity inhibition rate was 223.5% in the group of purified fraction ③，it was significantly higher than that of the purified fraction ① group (81.5%) and the purified fraction group ② (201.8%)，the tyrosinase activity inhibition rates in the hydroquinone and Vc positive control group were significantly lower than that of the purified fraction ③ group until the sample concentration was increased to>2 mg/mL.Conclusion：The chloroform extracts and its purified fraction ofPoriacocostriterpene have a better inhibiting tyrosinase activity，it can effectively regulate melanin formation reaction，and is suitable to develop the products for skin-whitening and treating freckles，moles，as well as other skin diseases.

Poriacocos；melanin；tyrosinase；dispel freckle；whitening

] 楊蓉婭，主任醫(yī)師，教授，研究方向：皮膚病理學(xué)；Tel：(010)65383718

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.012

2015-12-21)

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