李利生，陸 陽，楊斯雷，石京山

(1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室及特色民族藥國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系 化學(xué)教研室，上海 200025；3.奧林巴斯(中國)有限公司，北京 100015)

技術(shù)與方法

一種神經(jīng)元軸突變性的量化分析方法

李利生1，陸 陽2，楊斯雷3，石京山1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室及特色民族藥國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系 化學(xué)教研室，上海 200025；3.奧林巴斯(中國)有限公司，北京 100015)

目的建立一種神經(jīng)元軸突變性的量化分析方法。方法采用Aβ25-35(10-7、10-6、10-5mol/L)誘導(dǎo)的大鼠原代海馬神經(jīng)元軸突變性模型，經(jīng)神經(jīng)元特異性標(biāo)記蛋白β Ⅲ Tubulin免疫熒光染色獲得神經(jīng)元形態(tài)學(xué)熒光圖像。熒光圖像經(jīng)二維消卷積和二元化處理，將熒光標(biāo)記的神經(jīng)元區(qū)域轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏y量其面積，即為神經(jīng)元總面積。應(yīng)用ImageJ軟件的顆粒分析功能測量軸突變性產(chǎn)生的片段和顆粒面積，并計算其占神經(jīng)元總面積的百分比，即可獲得神經(jīng)元軸突變性的量化數(shù)據(jù)，命名為變性指數(shù)(degeneration index，DI)。Western blot測定突觸后致密蛋白95(postsynaptic density 95，PSD95)和突觸素( synaptophysin，SYN)蛋白變化。Pearson法分析DI與PSD95、SYN變化的相關(guān)性。結(jié)果免疫熒光染色結(jié)果顯示Aβ25-35可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元軸突變性，DI顯著高于對照組并呈劑量依賴性，PSD95和SYN蛋白水平顯著降低，與DI變化呈顯著正相關(guān)。結(jié)論本方法可獲得準(zhǔn)確的神經(jīng)元軸突變性的量化數(shù)據(jù)。

神經(jīng)元；軸突變性；Aβ25-35；變性指數(shù)；免疫熒光；消卷積

神經(jīng)元軸突的功能是將神經(jīng)沖動通過突觸傳遞到另一個神經(jīng)元或所支配的細(xì)胞上，軸突結(jié)構(gòu)和功能的完整性是神經(jīng)系統(tǒng)功能的基礎(chǔ)。軸突變性是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、外傷、感染、神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病的常見形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理變化的基本特征之一[1]，表現(xiàn)為神經(jīng)元形態(tài)改變、線粒體膜電位丟失、軸突轉(zhuǎn)運功能受損、ATP生成減少、鈣內(nèi)流增加、神經(jīng)絲降解和微管斷裂等[2]。在體外實驗研究中，常采用貧營養(yǎng)、Aβ、缺氧等措施復(fù)制神經(jīng)元軸突損傷模型。盡管導(dǎo)致軸突變性的原因甚至機制不盡相同，但形態(tài)學(xué)改變基本一致，表現(xiàn)為軸突斷裂、顆?；誓钪闃?，甚至降解消失并累及胞體[3]，通過相差顯微成像、銀染、免疫組織化學(xué)等方法能夠清晰地反應(yīng)變性的軸突的形態(tài)改變，也是判斷軸突變性的金指標(biāo)[4]，但對軸突變性程度的定量分析尚缺乏準(zhǔn)確、快捷、客觀的方法，本文詳細(xì)介紹一種軸突變性的量化分析方法以供同行參考。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠，10只，雄雌各半，10 周齡，體重200～250 g。第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0005，用于交配繁殖，出生24 h的健康乳鼠用于實驗。SPF級屏障環(huán)境飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證號：SYXK(黔)2014-003。

1.2 藥品、試劑及主要儀器設(shè)備 Aβ25-35購自美國Sigma公司 (分子式： C45H81N13O14S；分子量：1060.27；純度： ≥ 97%；產(chǎn)品編號：A4559)?？偟鞍滋崛≡噭┖匈徸员本┢绽R基因技術(shù)有限公司(產(chǎn)品編號：P1250)，Mouse Anti-GAPDH antibody、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 、DAPI和 BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司(產(chǎn)品編號分別為：AG019、A0208、A0216、C1005、P0010)，Rabbit polyclonal Anti-postsynaptic density 95(PSD95)antibody(美國Abcam,產(chǎn)品編號：ab18258)，Rabbit polyclonal Anti-Synaptophysin(SYN) antibody (美國Abcam，產(chǎn)品編號：ab32594)，Mouse monoclonal Anti-beta III Tubulin antibody (美國Abcam,產(chǎn)品編號：ab14545) ，Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor?488) secondary antibody (美國Abcam,產(chǎn)品編號：ab150113)，ECL免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑為上海七海生物科技有限公司產(chǎn)品(產(chǎn)品編號：E003-050)?；罴?xì)胞工作站(日本Olympus公司)，CellSens Dimension生命科學(xué)圖像處理軟件 (Version 510,日本Olympus公司)，ImageJ(1.44P，美國NIH)。

2 方法

2.1 海馬原代神經(jīng)元培養(yǎng) SD乳鼠經(jīng)75%酒精全身皮膚消毒，斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬，剝離血管及腦膜，置于預(yù)冷(4 ℃)的D-hanks液中，剪碎，胰蛋白酶(0.125%)消化(室溫)5 min，期間輕柔吹打，400目濾網(wǎng)過濾，180 g離心10 min，DMEM/F12(含10%馬血清、10%胎牛血清、1%雙抗)培養(yǎng)基重懸并計數(shù)。玻片經(jīng)多聚賴氨酸包被后置于24孔板中，將細(xì)胞懸液接種于24孔板于37 ℃，5% CO2環(huán)境下爬片培養(yǎng)，細(xì)胞密度為105個/孔。2 h后將培養(yǎng)基更換為Neurobasal medium (含2% B27)，每48 h換液，培養(yǎng)至第7天即可用于實驗。

2.2 復(fù)制神經(jīng)元軸突損傷模型 Aβ25-35溶于雙蒸水，并置于37 ℃連續(xù)孵育7 d，誘導(dǎo)其形成聚集態(tài)，儲備液濃度為10-3mol/L。取形態(tài)和密度理想的神經(jīng)元，更換新鮮的培養(yǎng)基并加入聚集態(tài)的Aβ25-35，終濃度分別為10-5、10-6、10-7mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)神經(jīng)元軸突變性模型。

2.3 軸突變性量化分析方法

2.3.1 免疫熒光法標(biāo)記神經(jīng)元 選用神經(jīng)元特異性標(biāo)志蛋白β III Tubulin抗體經(jīng)免疫熒光對海馬神經(jīng)元進行標(biāo)記[5]。具體方法概述如下：爬片培養(yǎng)的神經(jīng)元經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗后加入0.3% Triton-X100，室溫孵育10 min，PBS清洗后加入山羊血清室溫封閉30 min，棄山羊血清后直接滴加Anti-β III Tubulin antibody(1∶1 000)4 °C孵育過夜，PBS清洗后滴加Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor?488)熒光二抗，37 ℃避光30 min，PBS清洗后DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.3.2 消卷積處理 使用CellSens生命科學(xué)圖像處理軟件對2.3.1中獲得原始圖像進行消卷積處理，具體方法如下：(1)如圖1所示，將圖像轉(zhuǎn)換為多通道、8位/通道模式。(2)校準(zhǔn)圖像：采用“交互式校準(zhǔn)”模式，并根據(jù)比例尺“設(shè)置參照距離”，見圖2。(3)驗證通道參數(shù)：調(diào)用“生命科學(xué)應(yīng)用”工具中的“驗證消卷積通道參數(shù)”對話框，進行參數(shù)設(shè)置。發(fā)射波長：根據(jù)所選熒光染料確定；球差：物鏡經(jīng)過球差校正者數(shù)值為0。 數(shù)值孔徑：所選物鏡的數(shù)值孔徑標(biāo)注在物鏡側(cè)面。 折射率：根據(jù)拍攝圖片所使用物鏡的介質(zhì)選擇。設(shè)置完成后點擊“確定”，見圖3。(4)消卷積處理：調(diào)用“生命科學(xué)應(yīng)用”工具中的“二維消卷積”工具，進行參數(shù)設(shè)置。應(yīng)用于：如果是多維圖像(時間、多層、多通道)，根據(jù)實際需要選擇處理對象。設(shè)置：①算法，二維CI消卷積：更真實反應(yīng)出原始圖像上的熒光強度差異。二維去光暈：更好的反應(yīng)出熒光表達的位置。本研究分析的目的是計算染色部位的面積，因此使用二維去光暈。②模態(tài)，熒光圖像選擇寬場。 其他方法拍攝的圖像選明場。③迭代，數(shù)值大小可改變將二維消卷積濾鏡應(yīng)用至圖像，通常使用默認(rèn)值1。④平滑因子，用于處理使用二維消卷積濾鏡后得到的圖像，減少因背景過高產(chǎn)生的顆粒感?？筛鶕?jù)圖像效果調(diào)整，所有圖像須統(tǒng)一該參數(shù)。 ⑤平鋪重疊：此功能會自動應(yīng)用。設(shè)置完成后點擊“確定”，即可生成消卷積處理圖像，見圖4。(5)將圖像轉(zhuǎn)換為灰度、8位/通道模式。

圖1 原始圖像模式轉(zhuǎn)換為多通道、8位/通道模式 圖2 采用交互式校準(zhǔn)模式校準(zhǔn)圖像

圖3 驗證消卷積通道參數(shù)設(shè)置界面 圖4 二維消卷積設(shè)置界面

2.3.3 測量軸突總面積 使用Image J軟件打開上述消卷積處理后的圖片，進行“二元化”處理，即將圖像上的像素點的灰度值設(shè)置為0或255，使圖像非黑即白，使熒光著色區(qū)域轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?。設(shè)定閾值為255即全部黑色區(qū)域被選定，測量選定區(qū)域面積，即為神經(jīng)元總面積。

2.3.4 測量變性的軸突面積 使用Image J軟件打開上述“二元化”處理后的圖片，調(diào)用“Analyze particles”工具，設(shè)置待測顆粒大小范圍，輸入數(shù)值應(yīng)為像素的二次方，該項設(shè)置對測量結(jié)果具有重要影響，需根據(jù)所有樣本神經(jīng)元的軸突變性情況進行調(diào)整，且所有樣本必須采用統(tǒng)一數(shù)值范圍測量。設(shè)定閾值為0，測量選定區(qū)域面積，即為變性的軸突面積。

2.3.5 計算軸突變性指數(shù)(degeneration index，DI) 計算變性的軸突面積與神經(jīng)元總面積的比值，即為DI。

2.4 Western blot檢測PSD95和SYN蛋白量 收集經(jīng)Aβ25-35處理的神經(jīng)元，使用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，熱變性(95 ℃，10 min)后經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，統(tǒng)一上樣量為20 μg蛋白/泳道，用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，Mouse Anti-GAPDH antibody(1∶1 000)、Rabbit polyclonal Anti- PSD95 antibody(1∶1 000)或Rabbit polyclonal Anti- SYN antibody(1∶1 000)孵育過夜(4 ℃)。二抗(羊抗兔，1∶1 000；兔抗小鼠，1∶1 000)室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光液孵育2 min，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，經(jīng)Image J軟件測定條帶灰度值，計算目的蛋白與GAPDH條帶灰度值之比，即為目的蛋白的相對表達量。

3 結(jié)果

3.1 原代海馬神經(jīng)元鑒定 如圖5所示，神經(jīng)元培養(yǎng)1周時可見神經(jīng)元胞體呈梨形和圓球形，樹突短而粗，軸突細(xì)而長，末端分支較多，胞核呈圓形，位于細(xì)胞中央，為典型的神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特征。神經(jīng)元特異性標(biāo)記蛋白β III Tubulin免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)著色區(qū)域與明場所示的細(xì)胞區(qū)域基本一致，DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核與β III Tubulin陽性細(xì)胞胞體重疊率達95%，表明細(xì)胞為高純度的原代海馬神經(jīng)元。

圖5 原代海馬神經(jīng)元鑒定(×200，比例尺：50 μm)

圖6 軸突變性量化分析中各處理措施獲得的代表性圖像(×200，比例尺：50 μm)

3.2 軸突變性量化分析結(jié)果 在熒光顯微術(shù)中，來自焦平面上方或下方區(qū)域的漫射光會導(dǎo)致過度曝光、畸變和模糊，如圖6所示，由于漫射光使神經(jīng)元原始圖像輪廓模糊、邊界不清，無法準(zhǔn)確測量熒光區(qū)域的面積。經(jīng)二維消卷積處理后，光暈被消除，圖像更加銳利，神經(jīng)元邊界更加清晰，熒光表達的位置更加精確。隨后，二元化處理將圖像待測區(qū)域全部轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?，即熒光區(qū)域全部轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?。ImageJ軟件的顆粒分析功能可根據(jù)設(shè)定的顆粒大小圈定待測區(qū)域即為變性的軸突面積。Aβ25-35(10-7、10-6、10-5mol/L)作用48 h使軸突斷裂、顆?；?，在10-7mol/L劑量時，軸突呈念珠樣改變，但軸突的分布走向仍清晰可見，胞體完整。隨著Aβ25-35劑量增加，神經(jīng)元胞體逐漸消失、軸突完全顆?；窠?jīng)元形態(tài)無法辨認(rèn)。量化結(jié)果顯示，Aβ25-35各劑量組DI均顯著高于對照組，且呈劑量依賴性(見圖7)。DI變化趨勢與形態(tài)學(xué)顯示的軸突變性的嚴(yán)重程度一致。

與對照組比較，*P<0.05。 圖7 Aβ25-35致海馬神經(jīng)元軸突損傷量化分析統(tǒng)計圖

3.3 DI與PSD95及SYN蛋白量相關(guān)性分析 Aβ25-35處理組神經(jīng)元PSD95蛋白量顯著降低(P<0.05)，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，SYN蛋白量與PDS95變化一致(見圖8)。如表1所示，在Aβ25-35所致的海馬神經(jīng)元軸突損傷模型中，DI與PSD95及SYN蛋白量的變化成顯著正相關(guān)。

表1 DI與PSD95及SYN蛋白量相關(guān)性分析

變量DIrPPSD95/GAPDH0.7590.001SYN/GAPDH0.7300.009

與對照組比較，*P<0.05。 圖8 Aβ25-35對海馬神經(jīng)元PSD95和SYN蛋白量的影響

4 討論

神經(jīng)元屬不可再生細(xì)胞，盡管在胚胎或新生兒階段，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元軸突損傷后可再生修復(fù)，但發(fā)育成熟后由于神經(jīng)元的再生能力降低和所處環(huán)境的抑制，軸突再生困難，特別是當(dāng)軸突變性波及胞體時，臨床治療更加棘手[6]。因此，研究軸突變性的發(fā)生機制及促進再生的治療措施具有重要的臨床意義。

體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元軸突變性模型被廣泛用于軸突變性相關(guān)疾病的研究。神經(jīng)元軸突變性定性方法較多，常采用不同的染色方法如H&E染色、Nissl染色[7]、銀染[8]等結(jié)合顯微成像技術(shù)判斷是否存在軸突變性并對其嚴(yán)重程度作出主觀判斷，H&E染色和相差顯微成像技術(shù)為非神經(jīng)元特異性方法，無法排除體外培養(yǎng)的細(xì)胞中少數(shù)非神經(jīng)元細(xì)胞的影響。選擇神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物作為抗原，經(jīng)免疫熒光染色不僅可以清晰的顯示神經(jīng)元軸突變性情況，而且可以排除培養(yǎng)體系中非神經(jīng)元細(xì)胞的影響[9]。在神經(jīng)元軸突變性定量分析方面，有報道通過計算軸突變性細(xì)胞率、測量軸突長度及分支數(shù)量、利用相差顯微拍攝技術(shù)獲得的圖像計算DI等定量分析方法[5,9]，這些方法均存在較大的缺陷，如軸突變性細(xì)胞率不能反映單個細(xì)胞軸突變性的程度、神經(jīng)元密度較大時無法分辨軸突的歸屬和起止點等。我們結(jié)合文獻并改進了軸突變性的量化分析方法，該方法具有以下優(yōu)點：首先，選用神經(jīng)元特異性標(biāo)記物對神經(jīng)元進行熒光標(biāo)記，既可以清晰的顯示軸突變性的形態(tài)學(xué)改變，又可以提高后續(xù)量化分析的特異性，排除非神經(jīng)元的影響。其次，不必確認(rèn)變性軸突的歸屬及軸突的長度，對培養(yǎng)體系中神經(jīng)元密度的要求不高；再次，采用二維消卷積圖像處理技術(shù)去除熒光著色區(qū)的漫射光，使神經(jīng)元著色區(qū)域邊界更加清晰，便于精確測量區(qū)域面積。最后，采用ImageJ圖像處理軟件面積測定功能和顆粒分析功能，實現(xiàn)全自動獲取神經(jīng)元總面積和顆?；妮S突面積，可避免手動測量的主觀因素影響。

PSD95是突觸后致密區(qū)的骨架蛋白，可錨定膜受體、調(diào)節(jié)黏附分子、離子通道和谷氨酸受體的定位，參與突觸形成和經(jīng)突觸的信號傳遞[10]。SYN是一種位于突觸囊泡膜上的鈣結(jié)合蛋白，與突觸的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，是突觸發(fā)生的標(biāo)志[11]。當(dāng)神經(jīng)元受損時SYN和PSD95表達均明顯下降[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)在Aβ25-35所致的海馬神經(jīng)元軸突損傷模型， PSD95和SYN蛋白水平明顯降低，且與DI改變呈顯著正相關(guān)，表明本文介紹的軸突損傷量化分析方法結(jié)果是準(zhǔn)確的。

總之，本文介紹的軸突變性定量分析方法將免疫熒光染色與CellSens Dimension生命科學(xué)圖像處理軟件、ImageJ圖像處理軟件相結(jié)合，具有免疫熒光的特異性，圖像處理軟件全自動獲取原始數(shù)據(jù)具有客觀性和準(zhǔn)確性等優(yōu)點。

[1] Fang W,Gao G,Zhao H,et al.Role of the Akt/GSK-3β/CRMP-2 pathway in axon degeneration of dopaminergic neurons resulting from MPP+ toxicity [J].Brain Res,2015,1602:9-19.

[2] Neukomm L J,Freeman M R.Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration [J].Trends Cell Biol,2014,24(9):515-523.

[3] Lingor P,Koch J C,Tonges L,et al.Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS [J].Cell Tissue Res,2012,349(1):289-311.

[4] 王振宇.中樞神經(jīng)損傷后軸突變性的研究進展[J].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(1):49-52.

[5] Nikolaev A,McLaughlin T,O Leary D D M,et al.APP binds DR6 to trigger axon pruning and neuron death via distinct caspases [J].Nature,2009,457(7232):981-989.

[6] Apara A,Goldberg J L.Molecular mechanisms of the suppression of axon regeneration by KLF transcription factors [J].Neural Regen Res,2014,9(15):1418-1421.

[7] Adams J H,Doyle D,Ford I,et al.Diffuse axonal injury in head injury:definition,diagnosis and grading [J].Histopathology,1989,15(1):49-59.

[8] Thompson K J,Harley C M,Barthel G M,et al.Plasmon resonance and the imaging of metal-impregnated neurons with the laser scanning confocal microscope [J].eLife,2015,4:1-14.

[9] Alobuia W M,Xia W,Vohra B P S.Axon degeneration is key component of neuronal death in amyloid-β toxicity[J].Neurochemistry International,2013,63(8):782-789.

[10]Savioz A,Leuba G,Vallet P G.A framework to understand the variations of PSD-95 expression in brain aging and in Alzheimer's disease [J].Ageing Res Rev,2014,18:86-94.

[11]余萍萍,王莉,唐凡人,等.白藜蘆醇對大鼠腦缺血再灌注損傷后突觸素表達的影響[J].解剖學(xué)報,2016,47(1):12-17.

[12]金鳳,金海,吳芹,等.淫羊藿苷對Aβ25-35誘導(dǎo)的阿爾采末病大鼠海馬突觸素和突觸后密度蛋白95表達的影響[J].中國新藥與臨床雜志,2014,33 (5):394-398.

(編輯：譚秀榮)

A quantitative analysis method of axonal degeneration

Li Lisheng1,Lu Yang2,Yang Silei3,Shi Jingshan1

(1.Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Chemistry,Basic Medical Faculty,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai,200025,China; 3.OLYMPUS (China) Co.,Ltd.,Beijing 100015,China)

ObjectiveTo establish a quantitative analysis method for axonal degeneration of neurons.MethodsThe axonal degeneration of the primary hippocampus neurons isolated from the neonatal rat was induced by Aβ25-35(10-7,10-6,10-5mol/L).The profile of neurons was visualized by immunofluorescence staining using mouse monoclonal anti-beta III tubulin antibody.The fluorescence image was manipulated by the two dimensional deconvolution and binarization transformation such that pixel intensity of regions corresponding to neurons were converted to black and all the other regions were converted to white .The total number of black pixel was measured as the total neurons area.The particle analyzer module of ImageJ software was used to count the area of the small fragments or particles.The percentage of area of the small fragments or particles in total neurons area was calculated,which was named degeneration index (DI).Western blot was employed to determine the protein levels of postsynaptic density protein 95 (PSD95) and synaptophysin (SYN).Correlation analysis of DI with PSD95 and SYN were executed by Pearson.ResultsThe results of immunofluorescence staining showed that Aβ25-35treatment led to the significant axonal degeneration of the hippocampus neurons,significantly increased DI with a dose-dependence manner and obviously reduced the protein levels of PSD95 and SYN.There was a significant positive correlation between DI and PSD95 and SYN protein levels.ConclusionThis method can be used to obtain accurate quantitative data of axonal degeneration.

neuron; axonal degeneration; Aβ25-35; degeneration index; immunofluorescence; deconvolution

國家自然科學(xué)基金資助項目(NO：81473201)；貴州省教育廳 “125”重大科技專項(NO：2012012)。

石京山，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail:shijs@zmc.edu.cn。

Q189

A

1000-2715(2017)04-0440-06

[收稿2017-05-16;修回2017-06-12]