秦 峰 曾德龍 高成偉 秦新民

(廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，桂林，541004)

無蹼壁虎線粒體全基因組及系統(tǒng)發(fā)育分析

秦 峰 曾德龍 高成偉 秦新民*

(廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，桂林，541004)

稿件運(yùn)行過程

無墣壁虎； 線粒體基因組； 系統(tǒng)發(fā)育

無蹼壁虎(Gekkoswinhonis)屬壁虎科(Gekkonidae)壁虎屬動(dòng)物，主要分布于遼寧、河北、陜西、河南、山東、江蘇、安徽、浙江、廣西等地，常見于暖溫帶以及棲息在建筑物的縫隙、巖縫、石下及樹上。無蹼壁虎為我國(guó)的特有物種，該物種已被列入中國(guó)國(guó)家林業(yè)局2000年8月1日發(fā)布的《國(guó)家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究?jī)r(jià)值的陸生野生動(dòng)物名錄》。人們對(duì)無蹼壁虎的形態(tài)、生態(tài)、行為，以及藥用價(jià)值等方面進(jìn)行過研究[1-6]，但其線粒體基因組和系統(tǒng)發(fā)育的研究尚未見報(bào)道。本文對(duì)無蹼壁虎的線粒體基因組進(jìn)行了測(cè)序和基因組結(jié)構(gòu)特征分析，并對(duì)無蹼壁虎的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

無蹼壁虎，采集于廣西壯族自治區(qū)防城港。取其尾部肌肉為實(shí)驗(yàn)材料 。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取

DNA提取方法參照汪永慶等[7]報(bào)道的SDS/蛋白酶K裂解法進(jìn)行。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)、PCR 擴(kuò)增及序列測(cè)定

本研究中部分PCR引物參考已公布的線粒體基因組擴(kuò)增通用引物[8]，其余通過從Genbank下載壁虎科、蜥蜴科(Lacertidae)的線粒體基因組全序列或部分序列用軟件Clustal X 1.83比對(duì)，以找到合適保守位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出含簡(jiǎn)并位點(diǎn)的引物。部分引物無法擴(kuò)增出產(chǎn)物，待其他片斷序列完成后用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，使所設(shè)計(jì)的引物能夠擴(kuò)增出覆蓋無蹼壁虎的線粒體全基因組序列(表1)。

表1 擴(kuò)增無蹼壁虎線粒體基因組全序列所用的引物

Tab.1 List of primers used to amplify and sequence the mitogenome of Gekko swinhonis

注：簡(jiǎn)并引物中所用的字符：R(A，g)，Y(C，T)，M(A，C)，K(g，T)，S(g，C)，W(A，T)，H(A，T，C)，B(g，T，C)，D(g，A，T)，N(A，T，g，C)

Note：Characters of degenerate primer are as follow：R(A，g)，Y(C，T)，M(A，C)，K(g，T)，S(g，C)，W(A，T)，H(A，T，C)，B(g，T，C)，D(g，A，T)，N(A，T，g，C)

本實(shí)驗(yàn)PCR的反應(yīng)體系為50 μl，包括：25 μl 2×TaqPCR Master Mix(TIANGEN)，上、下游引物各0.5 μl，模板總DNA 1.0 μl，ddH2O 23 μl。

PCR的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；退火30 s，溫度因引物而異，約比引物Tm值低2～5℃；72℃延伸，時(shí)間因各所擴(kuò)片斷而異，按1min/kb設(shè)置；循環(huán)次數(shù)為35次；循環(huán)結(jié)束后72℃保溫10 min。

非簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增且無雜帶的PCR產(chǎn)物直接委托華大基因進(jìn)行雙向測(cè)序，少數(shù)含非特異性條帶的PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后再測(cè)序。簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增的PCR片段經(jīng)純化后與TaKaRa pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌后再用載體的通用引物測(cè)序。

1.2.3 序列拼接及注釋

經(jīng)測(cè)序得到的DNA片斷用DNAStar(DNASTAR，Inc.)軟件包的SeqMan進(jìn)行組裝拼接。各蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因通過與GenBank中近緣物種的線粒體基因進(jìn)行同源比對(duì)定位。tRNA基因的查找、定位及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用在線版的tRNAscan-SE Search Server[9]。用MEGA 4.1[10]軟件對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行翻譯，最后用Sequin 11.0對(duì)全序列進(jìn)行注釋，并提交至GenBank(登錄號(hào)：JQ906550)。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將35個(gè)物種(包括外群)線粒體全基因組13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸序列進(jìn)行構(gòu)樹。構(gòu)建系統(tǒng)樹前，利用Clustal X 1.83的默認(rèn)設(shè)置，將核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)。然后，經(jīng)過軟件Modeltest 3.7檢測(cè)，得出用于BI法分析的最適的核苷酸和氨基酸的替代模型為GTR+I+G。最后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果

2.1 全基因組的序列結(jié)構(gòu)和堿基組成

2.1.1 基因組結(jié)構(gòu)特征

無蹼壁虎的mtDNA為閉合環(huán)狀DNA，全長(zhǎng)16 818 bp，經(jīng)注釋的序列已提交至GenBank(登錄號(hào)為JQ906550)。無蹼壁虎線粒體基因組共有37個(gè)基因(圖1，表2)，包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因、1個(gè)主要的非編碼區(qū)(D-loop)、2個(gè)核糖體rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA)。其中13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因包括細(xì)胞色素b基因、腺苷三磷酸酶亞基(ATP6，ATP8)、細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ-Ⅲ基因(CO1-CO3)和7個(gè)NADH氧化還原酶亞基(ND1-DN6，ND4L)。

圖1 無蹼壁虎線粒體基因組基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Diagram of structure of Gekko swinhonis mitogenome

2.1.2 堿基組成特征

無蹼壁虎線粒體基因組不同區(qū)域和蛋白質(zhì)編碼基因密碼子各位置的堿基組成見表3。全基因組的A+T(57.63%)含量高于G+C(42.37%)，呈現(xiàn)GC偏斜，GC偏斜為-0.308，AT偏斜值為0.088。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因平均AT含量為57.65%。密碼子第一到第三位的AT含量分別為：52.25%，58.44%和62.27%。從表3可以看出，密碼子不同位置的AT偏向性的程度也不同，AT含量最低的是第一位，最高的是第三位，這主要是因?yàn)槊艽a子第三位置上的堿基受到的功能選擇壓較小，可以自由突變，所以受不同鏈的AT偏好影響較大。

2.1.3 蛋白質(zhì)編碼基因

無蹼壁虎線粒體的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，12個(gè)基因都使用ATG為起始密碼子，只有ND2基因以ATA為起始密碼子。無蹼壁虎5個(gè)基因(ND1、ATP8、ATP6、ND4L、ND4)以TAA為終止密碼子，ND6和Cytb兩個(gè)基因以TAG為終止密碼子，CO1以AGA為終止密碼，其余5個(gè)基因?yàn)椴煌耆K止密碼TA-或T-(ND2、CO2、ND5和CO3為T-，ND3為TA-)。

利用MEGA 5.1軟件對(duì)無蹼壁虎線粒體基因組去除終止密碼后的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的相對(duì)同義密碼子使用頻率(relative synonymous codon usage，RSCU)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(表4)。無蹼壁虎使用最多的氨基酸均為亮氨酸(L)，使用頻率為659，而且亮氨基的密碼子恰是20種氨基酸中最多的一個(gè)，一共有6個(gè)同義密碼子。單個(gè)密碼子的使用情況，CUA(231次)，AUU頻率為150。由于密碼子第三位置強(qiáng)烈AT偏向性的影響，同一個(gè)氨基酸的幾個(gè)同義密碼子中，NNU和NNA密碼子RSCU基本都大于1。

表2 無蹼壁虎線粒體基因組結(jié)構(gòu)和特征

Tab.2 Organization and features of Gekko swinhonis mitochonrial genome

表3 無蹼壁虎線粒體基因組不同區(qū)域的堿基組成

Tab.3 Nucleotide composition of the mitochondrial genome of Gekko swinhonis

表4 無蹼壁虎線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子使用頻率及相對(duì)同義密碼子使用情況

Tab.4 Codon frequency and relteive synonymous codon usage(RSCU)of Gekko swinhonis mitogenome protein-coding genes

注：終止密碼子未統(tǒng)計(jì)

Note：Termination codons are excluded

2.1.4 核糖體RNA基因及轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因

無蹼壁虎2個(gè)核糖體RNA基因位于tRNAPhe和tRNALeu(UUR)基因之間，中間由tRNAVal基因隔開。12S rRNA基因全長(zhǎng)951 bp，各堿基含量分別為：33.23%(A)、20.40%(T)、28.29%(C)、18.09%(G)，AT含量為53.63%；16S rRNA基因全長(zhǎng)1 568 bp，各堿基含量分別為：33.99%(A)、20.41%(T)、27.23%(C)、18.37%(G)，AT含量為54.40%。22個(gè)tRNA基因的總長(zhǎng)度為1 514 bp，各堿基含量分別為：31.11%(A)、27.68%(T)、23.84%(C)、17.37%(G)，AT含量58.78%，其中最長(zhǎng)的tRNA為tRNALeu(UUR)和tRNASer(UCN)，長(zhǎng)度均為75 bp，最短的為tRNASer(GCU)，62 bp，其二級(jí)結(jié)構(gòu)缺失了DHU臂而未形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖2 無蹼壁虎tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.2 Predicted secondary structure of tRNAs in Gekko swinhonis

2.1.5 控制區(qū)

無蹼壁虎線粒體控制區(qū)(D-loop)位于tRNAPro和tRNAPhe之間，長(zhǎng)度為1 456 bp，占整個(gè)基因組的8.66%，其堿基組成為：31.99% A、27.96% C、13.57% G、26.48% T。在控制區(qū)的5′端存在一個(gè)重復(fù)6次的串聯(lián)重復(fù)序列(5′-TGAATATTATATAGTACATTATATTAATGATATGGGATATACTA GTATATAGTA CATACATTTACTTACCCCA-3′)，其中包含有1個(gè)終止序列(TAS)(5′-ACATTATATTAAT-3′)。此外，在控制區(qū)的3′端有3個(gè)CBS序列：分別為CSB-1(5′-ATTTCATTCATGCTCGATGGGCATA-3′)，CSB-2：(5′-CAAACCCCCCTTACCCC-3′)和 CBS-3(5′-CGCCAAACCCCTAAAACG-3′)。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了探討無蹼壁虎的系統(tǒng)發(fā)育地位，本研究從GenBank中下載了33個(gè)有鱗目(Squamata)物種(包括本研究的無蹼壁虎)，以鱷目(Crocodylia)的Caimancrocodylus和鳥綱的Buteobuteo2個(gè)物種作為外群。以35個(gè)物種(包括2個(gè)外群)線粒體基因組中13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸序列為數(shù)據(jù)集進(jìn)行BI系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，各物種的種名及GenBank登錄號(hào)見表5。

表5 本研究用于系統(tǒng)發(fā)育分析物種的相關(guān)信息

Tab.5 List of the complete mitogenome in the phylogenetic analyses

續(xù)表5

所構(gòu)建的BI系統(tǒng)發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)的支持率很高，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的后驗(yàn)概率(posterior probability)均為1.00(圖3)。系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)將有鱗目分為兩大支，一支蛇亞目(Serpentes)與端生齒類(Acrodonta)組成的姐妹支，另一支包括了由石龍子科(Scincidae)和雙足蜥科(Dibamidae)組成的小支再與美洲鬣蜥科(Iguanidae)相聚形成的姐妹支，蚓蜥亞目(Amphisbaenia)與蜥蜴科組成的姐妹支，以及夜蜥科(Xantusiidae)、環(huán)尾蜥科(Cordylidae)和壁虎科物種。

3 討論

本研究選用了鱷目的Caimancrocodylus和鳥綱Buteobuteo兩個(gè)物種作為外群，與內(nèi)群33個(gè)物種BI系統(tǒng)發(fā)育樹。

3.1 有鱗目的基部類群

Camp[11]基于形態(tài)特征將有鱗目劃分為鬣蜥亞目(Lguania)和硬舌亞目(Scleroglossa)。然而基于分子系統(tǒng)學(xué)的研究卻與形態(tài)學(xué)上的劃分方法不大一致，Vidal和Hedges[12]基于核基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹中雙足蜥科位于有鱗目的基部位置，Zhou等[13]基于線粒體全序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹中將有鱗目劃分為蛇亞目和蜥蜴亞目?jī)纱笾?，Albert等[14]同樣基于線粒體基因組全序列的研究又得出來另一個(gè)結(jié)果：蛇與端生齒類組成的姐妹群是有鱗目群。因此，在基于分子標(biāo)記的有鱗目系統(tǒng)發(fā)育研究中，有鱗目的基部類群尚存在較大的分歧。在本研究的BI系統(tǒng)發(fā)育樹中，蛇亞目與端生齒類組成的姐妹支，結(jié)果與Albert等[14]觀點(diǎn)相同，而不支持形態(tài)學(xué)上將有鱗目劃分為鬣蜥亞目和硬舌亞目的觀點(diǎn)。

圖3 基于 13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸序列構(gòu)建的BI系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 BI trees based on the concatenated amino acid sequences of the 13 PCGs

3.2 亞目分類單元的單系性

科級(jí)以上的分類群中，蚓蜥亞目、蛇亞目、端生齒類和蛇蚓下目(Anguimorpha)4個(gè)類群的單系性得到大部分系統(tǒng)樹的支持。其中，蛇亞目和端生齒類兩個(gè)類群的單系性BI系統(tǒng)樹中得到1.00的貝葉斯后驗(yàn)概率支持。但石龍子下目(Scincomorpha)的單系性在本研究中未得到支持。

3.3 科級(jí)分類單元的單系性

所選的物種范圍內(nèi)幾乎所有科級(jí)分類單元的單系性在所有系統(tǒng)發(fā)育樹中都得到支持。僅有蚓蜥科在所有的樹中都因短頭蚓蜥科(Trogonophidae)的嵌入而成為并系群，而且涉及到的4個(gè)物種的關(guān)系在所有的樹中也始終保存恒定，為(Blanuscinereus，(Diplometoponzarudnyi，(Amphisbaenaschmidti，Geocalamusacutus)))。

3.4 無蹼壁虎的系統(tǒng)發(fā)育

壁虎科在本研究的BI系統(tǒng)發(fā)育樹中呈現(xiàn)出單系性。無蹼壁虎屬壁虎科動(dòng)物，在BI系統(tǒng)樹中無蹼壁虎先與Tarentolamauritanica相聚，然后再與Coleonyxvariegatus聚為一支，與形態(tài)分類學(xué)的觀點(diǎn)相符。

近年來，隨著DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多物種的線粒體基因組全序列被測(cè)定，不少研究者開始利用線粒體基因組全序列的信息對(duì)有鱗目高階元的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行探討。Kumazawa(2004)[15]測(cè)定了4種蜥蜴和1種蛇類的線粒體基因組全序列，并從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了另4條有鱗目序列及其他外群，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹支持蛇與蜥蜴的單系性。Zhou等(2006)[13]利用15個(gè)有鱗目物種代表了13個(gè)科的線粒體基因組全序列，重構(gòu)了有鱗目系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果與Kumazawa[15]相似，同樣支持將有鱗目分為蛇亞目與蜥蜴亞目(Sauria)兩個(gè)姐妹支。它們結(jié)果還支持壁虎下目與蚓蜥的姐妹群關(guān)系，這一觀點(diǎn)與大部分形態(tài)學(xué)及分子數(shù)據(jù)的結(jié)論不一致。2006年，Douglas等[16]新測(cè)定了5種蛇的線粒體基因組全序列，但得出了與Zhou等[13]不一致的結(jié)果，認(rèn)為與蛇關(guān)系最近的是蚓蜥，并不支持有鱗目分為蛇亞目與蜥蜴亞目的觀點(diǎn)。隨后，Kumazawa(2007)[17]又新測(cè)定了來自7個(gè)不同科的有鱗目物種線粒體基因的序列，再次探討了有鱗目系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果依舊未能確定蛇類的位置，另顯示石龍子下目(Scincomorpha)為并系群，壁虎下目(Gekkota)位于有鱗目基部。

目前，基于形態(tài)和分子數(shù)據(jù)得到的有鱗目系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚沒有較一致的結(jié)論，真正弄清有鱗目?jī)?nèi)部的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍有待今后深入研究。

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Gekkoswinhonis； Mitochondrial genome； Phylogeny

經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，獲得了無蹼壁虎(Gekkoswinhonis)的線粒體基因組全序列，其總長(zhǎng)為16 818 bp，含有13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、2個(gè)rRNA基因、22個(gè)tRNA基因和1個(gè)控制區(qū)。各基因的位置、排列順序及轉(zhuǎn)錄方向均和大部分的有鱗目物種一致。無蹼壁虎線粒體基因組的堿基組成分別為：A(31.35%)、T(26.28%)、C(27.71%)、G(14.67%)。除Ser(GCU)缺失DHU臂外，其余的21個(gè)tRNA都可以形成典型三葉草結(jié)構(gòu)。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，除ND2基因以ATA為起始密碼子外，其余12個(gè)基因均使用ATG為起始密碼子。無蹼壁虎5個(gè)基因(ND1、ATP8、ATP6、ND4L、ND4)以TAA為終止密碼子，ND6和Cytb基因以TAG為終止密碼子，CO1以AGA為終止密碼，其余5個(gè)基因?yàn)椴煌耆K止密碼TA-或T-(ND2、CO2、ND5和CO3為T-，ND3為TA-)?？刂茀^(qū)位于tRNAPro和 tRNAPhe之間，全長(zhǎng)1 456 bp，含有一些終止相關(guān)序列和保守序列(TAS，CBS1-3)。基于13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因氨基酸序列構(gòu)建的BI系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，無蹼壁虎與壁虎科的Tarentolamauritanica的親緣關(guān)系最近。

Complete Mitochondrial Genome of Peking Gecko(Gekkoswinhonis)and Phylogenetic Analysis

Qin Feng Zeng Delong Gao Chengwei Qin Xinmin*

(College of Life Science，Guangxi Normal University，Guilin，541004，China)

The complete nucleotide sequence of the mitochondrial genome of Peking gecko(Gekkoswinhonis)was determined by using PCR amplification and DNA sequencing.The results indicated a circular molecule of 16 818 bp，including 13 protein-coding genes，2 rRNA genes，22 tRNA genes，as well as a control region(D-loop).The gene arrangement pattern，order，and transcribing directions proved like those of other Squamata species.The nucleotide compositions of A，T，C，G were 1.35%，26.28%，27.71% and 14.67%，respectively．The secondary structures of tRNAs were predicted by tRNAscan-SE online server，all the tRNAs could form the typical cloverleaf structure except for tRNASer(AGY)，whose T-arm was lacking.Excepting the initiation codons of the ND2 gene that were a CGA codon，the other protein coding genes started with an ATA codon.Within the stop codons of 13 protein-coding genes，five genes(ND1，ATP8，ATP6，ND4L and ND4)ended with TAA stop codon.Two genes(ND6 and Cytb)ended with TAG or COI with AGA.The remaining five genes(ND3 with TA-，ND2，ND5，COII and COIII with T-)had incomplete stop codons.The control region was located between the tRNAProand tRNAPhegenes，and was 1 456 bp in length.Some tandem repeat sequences and conserved elements(TAS，CSB1-3)were found in the control region.The Bayesian inference(BI)phylogenetic analyses based on the 13 PCG amino acid sequences showed that that Peking gecko is closely related toTarentolamauritanicawithin Gekkonidae.

廣西珍稀瀕危動(dòng)物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(1501z003)

秦峰，男，31歲，講師；主要從事動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)研究。

*通訊作者：秦新民，E-mail：xmqin@mailbox.gxnu.edu.cn

2016-07-03

Q951+.3 Q78

A

修回日期：2016-08-12

發(fā)表日期：2017-02-10

2310-1490(2017)01-094-09