季云， 李小琴， 趙婷玲， 孫慶梅， 嚴凌花， 李莉

臨床與基礎研究

干擾PRMT5表達肝癌細胞穩(wěn)轉細胞株的建立及鑒定

季云， 李小琴， 趙婷玲， 孫慶梅， 嚴凌花， 李莉

目的探討干擾蛋白質精氨酸甲基轉移酶5(PRMT5)表達肝癌細胞穩(wěn)轉細胞株的建立及鑒定。方法針對PRMT5設計出該基因的有效短發(fā)夾RNA(shRNA)片段，選擇合適慢病毒載體，通過基因工程技術，構建出PRMT5慢病毒載體介導的shRNA重組載體，并通過PCR以及測序檢測構建序列的正確性。將重組病毒載體在病毒包裝細胞中大量生產后，用病毒原液感染PRMT5表達量相對較高的SMMC-7721、BEL-7402細胞，2 d后，用最低殺死濃度的嘌呤霉素進行篩選，得到克隆樣生長的細胞，擴大培養(yǎng)后分別提取蛋白和RNA，Western 印跡和qPCR檢測PRMT5的表達。結果成功構建出由人源性PRMT5慢病毒載體介導的shRNA重組載體pLKO.1-sh-PRMT5，PCR及測序均證明構建序列的正確。Western 印跡法和qPCR檢測，pLKO.1-sh-PRMT5干擾組的PRMT5蛋白及mRNA水平明顯低于pLKO.1-sh-GFP組(P<0.05)，pLKO.1-sh-PRMT5載體具有良好的干擾效果。結論運用慢病毒感染并篩選出穩(wěn)轉細胞株，在干擾效率及經濟角度均優(yōu)越于瞬時轉染，為今后研究PRMT5在肝癌細胞中作用功能提供了良好的科研工具。

蛋白質精氨酸N-甲基轉移酶； RNA； 小分子干擾； 慢病毒屬； 載體蛋白質類； 蛋白質精氨酸甲基轉移酶5

蛋白質精氨酸甲基轉移酶5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)屬于蛋白質精氨酸甲基轉移酶(protein arginine methyltransferases，PRMTs)家族，它能將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉移到底物蛋白質中精氨酸的胍基上[1]。與其他的PRMTs家族成員不同，PRMT5能作用于細胞內不同的蛋白質，包括ATP依賴的染色質重塑和共抑制因子誘導的基因沉默。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，PRMT5參與細胞水平的生物學調控，如核糖體的合成[2]，高爾基體的組裝[3]，細胞的分化[4-6]和生殖細胞的分化[7-8]。越來越多的研究表明，PRMT5與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，PRMT5參與調控一些主要的信號轉導通路，繼而影響細胞死亡和惡性轉化[9]。本研究構建PRMT5 短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)慢病毒載體，靶向沉默PRMT5基因的水平，包裝慢病毒，感染肝癌細胞，篩選穩(wěn)轉細胞株， 并應用Western 印跡和qPCR分別檢測穩(wěn)轉細胞中PRMT5基因蛋白和mRNA水平，驗證其干擾效率。

1 材料與方法

1.1 細胞復蘇

細胞復蘇、傳代，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基預熱至37 ℃左右，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育(37 ℃、5%CO2)。

1.2 重組慢病毒載體構建

據Sigma官網提供的shRNA序列，設計對照組GFP shRNA干擾序列的引物。

sh-GFP:正向:5-CCGGGCAAGCTGACCCTGAAGT-TCATCTCGAGATGAACTTCAGGGTCACGTTGCTTTTTG-3;反向:5-AATTCAAAAAGCAAGCTGACCCTGAAGT-TCATCTCG-AGATGAACTCAGGGTCACGTTGC-3。

據Sigma官網提供的shRNA序列，選擇干擾效率達95%的PRMT5 shRNA干擾序列(此序列干擾PRMT5的3’非編碼端)。sh-PRMT5：正向5’-CCGGGGCTCAAGCCACCAATCTATGCTCGAGCATA GATTGGTGGCTTGAGCCTTTTTG-3’;反向5’-AATTCAAAAAGGCTCAAGCCACCAATCTATGCTCGAGC ATAGATTGGTGGCTTGAGCC-3。shRNA oligos退火，慢病毒骨架質粒pLKO.1-TRC雙酶切和膠回收。連接、轉化和菌液PCR鑒定，轉化連接反應產物時，設立對照組(即雙酶切后的連接產物)，挑多個單克隆菌落于含有1 ml含Amp的LB的微量離心管內，37 ℃，220 r/min細菌搖床上搖3～4 h，進行細菌擴增，以得到的菌液為模板，進行菌液PCR鑒定。

上述反應體系中引物序列：正向5’-GCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA-3’;反向5’-TGCCATTTGTCTCGAGGTCG-3。

測序鑒定：將質粒郵寄至南京金斯瑞公司進行測序，其測序引物為GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA。

1.3 包裝病毒

實驗前1天將293T傳代接種于6孔板內，接種密度以第2天匯合度達50%～70%為宜。轉染前給細胞換液(改為不含F(xiàn)BS的 DMEM)，使其饑餓2 h，以提高效率，以6孔板中的1個孔為例，細胞接種1×106個。

pLKO.1-sh-EGFP/pLKO.1-sh-PRMT5質粒1μgpsPAX2包裝質粒0.75μgpMD2.G穿梭質粒0.25μgLipofectamineTM2000/PEI4～6μl無血清培養(yǎng)基100μl

包裝上病毒的293T細胞生長緩慢，且形態(tài)變圓，培養(yǎng)基顏色變黃，48 h后吸取培養(yǎng)基于新的微量離心管，4 ℃，4 000 r/min離心10 min，去除細胞碎片等沉淀，所得的上清液即為病毒上清液，分裝于微量離心管內，-80 ℃冰箱保存。

1.4 感染細胞

取對數(shù)生長期的SMMC-7721和BEL-7402分別接種6孔板的兩個孔，細胞密度為3×106個/每孔。加病毒原液前換液，使用含聚凝胺的培養(yǎng)基，再分別加入200 μl pLKO.1-sh-PRMT5或pLKO.1-sh-GFP慢病毒原液(聚凝胺的最終濃度為8 μg/ml)，24 h后同樣的方法追加病毒1次。48 h后將培養(yǎng)基換為含嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行篩選(設立對照，即未感染病毒的SMMC-7721和BEL-7402)，使用濃度為最低殺死濃度，直至未感染病毒的對照組細胞完全被殺死。而實驗組細胞連續(xù)培養(yǎng)幾代后可見克隆樣細胞生長，此時改用低濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。所得到的細胞株分別為抑制GFP水平的穩(wěn)轉細胞株sh-GFP以及抑制PRMT5水平的穩(wěn)轉細胞株sh-PRMT5。

1.5 總RNA提取

用PBS清洗細胞1～2次，加入1 ml Trizol 裂解細胞10 min，混勻，按照試劑盒操作步驟提取總RNA，核酸蛋白儀測定RNA含量及純度，-80 ℃冰箱保存。

1.6 反轉錄和qPCR檢測方法

1.6.1 反轉錄 從-80 ℃冰箱取出提取的RNA，冰上融化，根據Thermo反轉錄反應試劑盒說明書進行。1.6.2 實時PCR mRNA PCR引物如下。GAPDH：正向5’-ACCATCTTCCAGGAGCGAGAT-3’，反向5’-ATGACGAACATGGGGGCATC-3’；PRMT5：正向5’-GGACGGAGAAGGGCAGACTA-3’，反向5’-CCCGCATCCAGAACATGGAA-3’。

計算結果用2-ΔΔCt表示，ΔCt=Ct(sh-PRMT5)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(sh-PRMT5)-ΔCt(sh-EGFP)。

1.7 Western印跡檢測方法

1.7.1 蛋白質提取 冰上操作：棄培養(yǎng)基，用預冷的PBS緩沖液洗1～2次，加入蛋白裂解液，刮下細胞于微量離心管中，冰上裂解30 min。在超聲波細胞破碎儀下超聲裂解細胞碎片，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，吸取上清置新的微量離心管，置于冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 免疫印跡 配膠、上樣、電泳、轉膜，用5%脫脂牛奶封閉液或5%BSA封閉液室溫封閉1～2 h，一抗孵育，4 ℃孵育過夜。漂洗，TBST漂洗3次，每次10 min。二抗孵育，放入稀釋的二抗(1∶5 000)。室溫下，搖床晃動2 h。洗凈二抗后，用濾紙吸干膜上的液體，將ECL發(fā)光液滴入膜上，確保膜各部分受液均勻，在電子凝膠成像系統(tǒng)下，顯影、拍照。

2 結果

2.1 pLKO.1-TRC質粒雙酶切

選取AgeI和EcoRI進行載體雙酶切，將產物行瓊脂糖電泳鑒定。結果顯示：泳道1是15 000 bpDNA標準參照物；泳道2為pLKO.1-TRC空載質粒；泳道3為pLKO.1-TRC空載質粒雙酶切成線性的片段。載體被切下了1 500 pb小片段，說明質粒pLKO.1-TRC雙酶切成功(圖2A)。

2.2 菌液PCR鑒定重組質粒pLKO.1-sh-PRMT5

PRMT5 shRNA oligos退火后與pLKO.1-TRC雙酶切后的產物連接后，轉入Stbl3后轉化。挑陽性單克隆加入至LB中擴增3～4 h，行菌液PCR鑒定。根據所設計的引物，陽性克隆菌液PCR可獲得257bp DNA片段(圖2B)，泳道2至泳道7無雜帶，且條帶位置正確，提示所構建的重組質粒pLKO.1-sh-PRMT5連接成功。

圖2 載體構建

2.3 pLKO.1-sh-PRMT5質粒測序結果

經菌液PCR鑒定為陽性克隆，進行質粒擴增后，抽提質粒送至南京金斯瑞公司測序，測序引物為：GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA。測序結果顯示(圖3A、圖3B)，標有下劃線部分的序列與本實驗設計的PRMT5 shRNA oligo前鏈完全一致，并附此部分序列的測序峰值圖，由此說明，所構建pLKO.1-sh-PRMT5質粒正確。

圖3A pLKO.1-sh-PRMT5質粒測序結果

圖3B pLKO.1-sh-PRMT5質粒測序峰值圖

2.4 檢測pLKO.1-sh-PRMT5干擾效率

慢病毒包裝后，鏡下細胞變圓變亮，且培養(yǎng)液由紅轉黃。用病毒原液感染PRMT5表達量相對較高的SMMC-7721、BEL-7402細胞2 d后，用最低殺死濃度的嘌呤霉素進行篩選，得到克隆樣生長的細胞，擴大培養(yǎng)后分別提取蛋白和RNA，Western 印跡和qPCR檢測PRMT5的表達。結果表明，pLKO.1-sh-PRMT5干擾組的PRMT5蛋白及mRNA水平明顯低于pLKO.1-sh-GFP組(P<0.05)(圖4)。提示pLKO.1-sh-PRMT5載體具有良好的干擾效果。

圖4 shRNA沉默肝癌細胞株PRMT5基因的驗證結果

3 討論

RNAi干擾是近年來日漸成熟的基因沉默技術，在1998年由Fire等首次提出[10]，它是由雙鏈RNA介導、Dicer酶參與的，能特異、高效地沉默靶向基因[11]。此項干擾技術在探索生物基因功能、人類傳染性疾病、免疫疾病及腫瘤發(fā)生機制和治療等領域應用廣泛。

RNAi干擾技術是將21～23個與目的基因同源的外源性核苷酸片段轉染至生物體內，在細胞內與dsd RNA特異性的RNAase Ⅲ endonuclease酶結合并誘導沉默復合體(RNA induced silencing complex，RISC)的形成，RISC以dsd RNA為模板特異地識別外源性基因表達的同源基因mRNA，并在結合部位對其進行剪切，導致被剪切的靶序列mRNA降解，從而抑制該基因的表達。RNAi技術能高效特異的阻斷基因的表達，使靶基因功能喪失或降低基因突變這一特性，使該技術被廣泛地應用到研究基因功能及腫瘤的基因治療領域。

RNAi在實際應用中仍存在許多技術難題：①因病毒的核酸復制缺乏嚴格的堿基修復系統(tǒng)，易出現(xiàn)堿基突變，影響干擾效果；②在高度折疊或二級結構中，隱藏在其中某些RNAi序列不被Dicer酶識別及切割，因此在科研中，常需選擇多個RNAi序列進行驗證，才能尋找到理想的siRNA識別部位[12]；③siRNA轉染效率低是科研技術上的難題[13]，但近年來基因技術日益成熟，轉染效率有所突破；④siRNA轉染效率低、時效性短(48 h后即開始降解)、穩(wěn)定性差。近年來，科研研究者們已成功的設計出一種shRNAi技術[11-12]，且該技術目前已較為成熟。在此基礎上，借助慢病毒載體，通過病毒干擾生物體提高了轉染效率及穩(wěn)定性，可長期的穩(wěn)定的表達，從經濟角度考慮，shRNA更占優(yōu)勢[14]。因此，我們采用慢病毒載體與短發(fā)夾RNA技術，克服傳統(tǒng)siRNA弊端，在干擾效率及經濟角度考慮均優(yōu)越于瞬時轉染，為今后研究PRMT5在肝癌細胞中作用功能提供了良好的科研工具。

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EstablishmentandidentificationofPRMT5transfectedhepatocellularcarcinomacellline

JIYun,LIXiaoqin,ZHAOTingling,SUNQingmei,YANLinghua,LILi.

(DepartmentofChemotherapy,CancerCenter,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China)

JIYun,Email:jy751121@163.com

ObjectiveTo investigate the establishment and identification of a stable cell line expressing protein arginine methyltransferase 5(PRMT5) interference in hepatocellular carcinoma cells.MethodsThe effective short hairpin RNA(shRNA) fragment of the PRMT5 gene was designed, By selecting the suitable lentiviral vector, the recombinant vector of PRMT5 lentiviral vector mediated by shRNA was constructed by gene engineering technology. The correctness of the sequence was detected by PCR and sequencing. Recombinant viral vectors were produced in a large number in viral packaging cells. SMMC-7721 and BEL-7402 cells with high expression of PRMT5 were infected with virus solution for 2 d. The cells presented with clone-like growth were cloned by using the minimum kill concentration of puromycin. The expression of PRMT5 was detected by Western blotting and qPCR after extracting the protein and RNA.ResultsShRNA recombinant vector pLKO.1-sh-PRMT5 was successfully constructed by human derived PRMT5 lentiviral vector, and the sequence of PCR was proved to be correct. Western blotting and qPCR detection showed that the expressions of PRMT5 and mRNA in the pLKO.1-sh-PRMT5 interference group were significantly lower than those of the pLKO.1-sh-GFP group(P< 0.05). pLKO.1-sh-PRMT5 vector had good interference effect of PRMT5 protein.ConclusionsThe lentiviral vector which used to screen the stable cell line, was superior to the transient transfection in the interference efficiency and economic point of view, which provided a good research tool for studying the function of PRMT5 in hepatoma cells in the future.

Protein-arginine N-methyltransferases; RNA; Small interfering; Lentivirus; Carrier proteins; Protein arginine methyltranserase 5

212001 江蘇 鎮(zhèn)江，江蘇大學附屬醫(yī)院 腫瘤治療中心 化療科

季云，Email：jy751121@163.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.03.014

1674-4136(2017)03-0186-05

2016-09-02][本文編輯：李慶]