周少杰， 畢鐵強， 秦春新， 楊小青， 矯璐宇， 于浩

乳腺癌專題

Nampt抑制劑對乳腺癌細胞化療增敏作用的研究

周少杰， 畢鐵強， 秦春新， 楊小青， 矯璐宇， 于浩

目的探討乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Nampt)的表達，及Nampt抑制劑對乳腺癌細胞生長和化療增敏的影響。方法采用qRT-PCR法檢測乳腺癌組織和癌旁正常組織中Nampt mRNA表達水平，并用噻唑藍(MTT)實驗和軟瓊脂克隆形成實驗檢測Nampt抑制劑對乳腺癌細胞生長的影響和對其化療增敏的作用。結(jié)果qRT-PCR結(jié)果表明，乳腺癌組織內(nèi)Nampt mRNA表達高于癌旁正常組織中的表達3.5倍 ，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)FK866干預24 h，細胞的生長沒有明顯的抑制；但在48 h、72 h后，F(xiàn)K866 (3～30 nmol/L) 干預 MCF-7細胞出現(xiàn)生長的抑制。隨FK866的濃度增加，細胞克隆球數(shù)逐漸減少，相鄰干預濃度的兩組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。結(jié)論Nampt抑制劑能影響乳腺癌細胞生長，與細胞毒藥物聯(lián)合應(yīng)用具有化療增敏作用。

乳腺腫瘤； 煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶； 細胞存活； 藥物療法; 化療增敏

化療是進展期乳腺癌治療的主要手段之一，化療通過改變細胞核DNA的化學結(jié)構(gòu)、微管蛋白合成、干擾核酸的合成和轉(zhuǎn)錄等抑制腫瘤細胞的生長,其主要目的是使惡性腫瘤細胞在抗腫瘤藥物的作用下發(fā)生凋亡。而惡性腫瘤細胞對化療藥物耐藥性是腫瘤化療失敗的主要原因之一。因此, 提高腫瘤細胞的化療敏感性，降低耐藥性，增加細胞毒抗腫瘤藥物的療效, 從而提高腫瘤患者的生存率, 已成為腫瘤藥物治療中亟待解決的問題之一。腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性分為內(nèi)在性和獲得性兩方面, 研究認為其分子機制涉及多藥耐藥相關(guān)基因表達異常, 癌基因和抑癌基因的表達異常及DNA損傷修復能力改變等多個方面。其中，腫瘤細胞對化療藥物引起的DNA損傷具有修復能力，是化療耐藥的一個重要原因。腫瘤細胞損傷后，DNA修復機制是腫瘤化療耐藥機制研究熱點之一，而煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)在DNA修復過程中具有重要作用，煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Nampt)是NAD補救合成過程中的限速酶[1]。研究腫瘤細胞抗凋亡、DNA修復過程中的功能因子，將其作為生物靶點，適當?shù)淖钄嗥渥饔?，可成為提高化療藥物效果的一種新方法。本研究中，我們通過PCR方法檢測了Nampt在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達，探討Nampt抑制劑對乳腺癌細胞生長的影響和對化療藥物敏感性的影響，為后續(xù)的研究奠定一定基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1 新鮮乳腺癌組織和癌旁正常組織 12例乳腺癌和癌旁正常組織(距腫瘤邊緣≥5 cm)取自2014年5月威海市立醫(yī)院甲乳外科手術(shù)切除的新鮮標本，術(shù)中均經(jīng)組織病理證實，且未做術(shù)前放化療?；颊呔鶠榕?，年齡29～66歲，平均年齡47歲，術(shù)后病理證實均為乳腺浸潤性導管癌，分級Ⅰ～Ⅲ級。

1.1.2 人乳腺癌細胞株和實驗用藥物 人乳腺癌細胞株 MCF-7使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。Nampt抑制劑FK866(美國Cayman公司)，25 mg/ml 5-氟尿嘧啶 (5-FU，天津金耀氨基酸公司)。實驗藥物在培養(yǎng)基中稀釋到設(shè)計濃度用于體外實驗。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR) 培養(yǎng)細胞中加入Trizol試劑提取總RNA。然后，通過cDNA合成試劑盒(日本Takara公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Nampt 產(chǎn)物長度250 bp，正向：5’-AAGAGACTGCTGGCATAGGA-3’；反向：5’-ACCACAGATACAGGCACTGA-3’。GAPDH 產(chǎn)物長度 452 bp，正向：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’；反向：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。在iCycler熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)中，通過SYBR Premix Ex Taq試劑盒(日本Takara公司)進行qRT-PCR檢測目標基因Nampt的表達，PCR重復3次。用管家基因GAPDH mRNA作內(nèi)參照。

1.2.2 噻唑藍法(MTT)檢測細胞生長 96孔板每孔加細胞懸液100 μl，每孔中種5 000個細胞，每組3個復孔。細胞貼壁后，加入不同濃度的藥物，依據(jù)實驗需要時間進行培養(yǎng)。呈色：每孔加入20 μl MTT溶液，使MTT終濃度為0.5 mg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔吸光度A值。測定波長490 nm?？瞻讓φ?培養(yǎng)基、MTT、DMSO)調(diào)零。

1.2.3 軟瓊脂克隆形成實驗 鋪0.6%底層膠，制備含有細胞的0.3%上層膠，混勻后加入到底層膠上，放入4 ℃冰箱中10 min使瓊脂糖凝膠凝固，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3周。觀察克隆數(shù)，計數(shù)最大徑>100 μm的克隆。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 Nampt在乳腺癌組織中的表達

qRT-PCR結(jié)果表明，乳腺癌組織內(nèi)Nampt mRNA表達高于癌旁正常組織中的表達3.5倍 ，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 qRT-PCR法檢測癌旁正常乳腺組織和乳腺癌組織Nampt mRNA表達對比

2.2 Nampt抑制劑FK866對MCF-7細胞生長的影響

經(jīng)FK866干預24 h，細胞的生長沒有明顯的抑制。但在48 h、72 h后，F(xiàn)K866 (3～30 nmol/L) 干預的 MCF-7細胞出現(xiàn)生長的抑制，圖2為不同濃度的FK866干預細胞72 h后部分96孔板細胞照片(隨濃度增加，細胞生長抑制越明顯)。MTT比色法分別于24 h、48 h和72 h檢測各組細胞的生長存活率，同細胞濃度組相比，48 h、72 h后細胞生長抑制差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

圖2 MTT比色法檢測前不同濃度的FK866干預細胞72 h后96孔板細胞(FK866濃度分別為0 nmol/L、0.3 nmol/L、3 nmol/L和30 nmol/L，隨濃度增加，細胞生長抑制越明顯)(HE×200)

圖3 24 h、48 h、72 h后，MTT比色法檢測FK866對MCF-7細胞生存率的影響

2.3 Nampt抑制劑FK866對 MCF-7細胞克隆集落生長的影響

相同條件下軟瓊脂中培養(yǎng)3周后，隨FK866的濃度增加，細胞克隆球形態(tài)逐漸減小，甚至出現(xiàn)細胞凋亡表現(xiàn)(圖4)。 FK866 能夠抑制 MCF-7細胞克隆集落生長，且與其劑量濃度相關(guān)，最低實驗濃度0.3 nmol/L即可抑制MCF-7細胞的集落生長，至30 nmol/L，最大徑>100 μm的克隆數(shù)為0，隨FK866的濃度增加，細胞克隆球數(shù)逐漸減少，相鄰干預濃度的兩組間差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。見圖5。

圖4 不同濃度FK866對 MCF-7細胞軟瓊脂克隆形成的比較(×200)

圖5 FK866對 MCF-7細胞軟瓊脂克隆形成的影響

2.4 FK866對 MCF-7細胞5-FU的化療敏感性的影響

FK866增加了MCF-7細胞5-FU的化療敏感性。MCF-7細胞中分別加入5-FU單藥和5-FU+FK866 (1 nmol/L) 培養(yǎng)24 h后(單用1 nmol/L劑量濃度的FK866對細胞生長無影響)，兩組間細胞生存率無差異。培養(yǎng)48 h和72 h后，5-FU+FK866組對細胞生長的抑制較5-FU組更明顯；加入FK866組的5-FU的半抑制濃度 (IC50) 更低。見圖6,7。

圖6 MTT比色法檢測48 h 5-FU和5-FU+FK866組細胞的吸光度值

圖7 MTT比色法檢測72 h 5-FU和5-FU+FK866組細胞的吸光度值

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Nampt在乳腺癌組織中的表達高于其在正常乳腺組織中的表達。Nampt抑制劑FK866 能抑制人乳腺癌細胞的生長和集落形成。由于5-FU聯(lián)合FK866(1 nmol/L) 對乳腺癌細胞的生長抑制比單用5-FU更明顯，而1 nmol/L的FK866對細胞生長無影響，因此認為，F(xiàn)K866 能夠增加5-FU對乳腺癌細胞的化療敏感性。眾所周知，腫瘤細胞克隆集落生長是其擴散轉(zhuǎn)移的重要因素，本研究發(fā)現(xiàn)， FK866 抑制乳腺癌集落形成的效果與其劑量濃度呈正相關(guān)；表明能夠阻斷Nampt信號通路的抑制劑可能對Nampt高表達的乳腺癌具有治療意義。

前期的研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細胞和腫瘤組織中Nampt高表達[2-4]。其通過調(diào)整與細胞粘附功能相關(guān)的整合素功能，以促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[5]。Nampt是一個在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用的腫瘤相關(guān)基因，其可成為腫瘤治療新的有效靶點[6-7]。臨床上應(yīng)用的細胞毒藥物大多是通過不同形式造成腫瘤細胞DNA損傷，當細胞DNA損傷時，其自身會啟動DNA損傷修復機制，維持自身生存，臨床上出現(xiàn)化療不敏感甚至耐受現(xiàn)象。Nampt通過參與DNA修復、調(diào)節(jié)ERK1/2和p38通路表達MMP-2/9等功能，促進腫瘤細胞的存活和增殖及血管生成[8]，且與化療抵抗相關(guān)[9-10]。Nampt抑制劑能夠耗竭腫瘤細胞內(nèi)NAD和抑制糖酵解途徑，從而抑制細胞生長[11-12]，與破壞DNA的細胞毒藥物聯(lián)合用藥，使DNA修復能力受損，加強了細胞毒藥物作用效果[13-14]。抗代謝藥物5-FU能夠通過阻斷胸苷酸合成，從而影響DNA鏈延長、改變DNA穩(wěn)定性，最終使DNA單鏈斷裂；因此，5-FU和FK866作用于完全不同的靶點途徑。本研究中，低劑量的FK866 (1 nmol/L) 增加了乳腺癌對5-FU的化療敏感性，進一步抑制細胞增殖和誘導凋亡。這種化療增敏機制可能是因為FK866降低了NAD合成從而增加了5-FU的細胞毒作用。今后的研究中，我們將對Nampt抑制劑對乳腺癌相關(guān)蛋白信號通路的影響機制進一步探討，以期為乳腺癌化療增敏和靶向治療策略提供新的線索。

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StudyofNampt-inhibitor-basedchemosensitizationeffectsinbreastcancercells

ZHOUShaojie,BITieqiang,QinChunxin,YANGXiaoqing,JIAOLuyu,YUHao.

(DepartmentofBreastSurgery,WeihaiMunicipalHospital,Weihai264200,China)

BITieqiang,Email: 37400704@qq.com

ObjectiveTo study the expression of nicotinamide phosphoribosyl transferase (Nampt) in breast cancer and investigate the effects of Nampt inhibitor on the growth and chemotherapy sensitivity of breast cancer cells.MethodsNampt mRNA expressions in breast cancer tissues and adjacent normal tissues were detected by qRT-PCR method; the effect of Nampt inhibitor on the growth of breast cancer cells and chemosensitization was detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and soft agar clonogenic assays.ResultsqRT-PCR showed that Nampt in breast cancer tissues was significantly higher than that in adjacent normal breast tissues (3 folds,P<0.05). After 24 h of FK866 intervention, there was no significant inhibition of cell growth, however, after 48 h and 72 h, FK866 (3 ～30 nmol/L) inhibited the proliferation of MCF-7 cells. With the increase of FK866 concentration, the number of cell clones decreased gradually, and there was significant difference between two adjacent intervention concentration groups (allP<0.01).ConclusionsOur findings indicate that Nampt may be a new therapeutic target for breast cancer, and combined therapy of Nampt and cytotoxic drugs has the effect of chemosensitization.

Breast neoplasms; Nicotinamide phosphoribosyl transferase; Cell survival; Drug therapy; Chemosensitization

264200 山東 威海，威海市立醫(yī)院 甲乳外科

畢鐵強， Email: 37400704@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.03.005

1674-4136(2017)03-0154-04

2017-02-07][本文編輯：李慶]