劉娟娟， 盧言菊,2， 陳玉湘,2， 趙振東,2*

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室；江蘇省 生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所，北京100091)

異海松基水楊酰腙的合成及細(xì)胞毒性評價

LIU Juanjuan

劉娟娟1， 盧言菊1,2， 陳玉湘1,2， 趙振東1,2*

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室；江蘇省 生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所，北京100091)

以水楊醛和異海松酸為原料，合成了異海松基水楊酰腙，通過IR,1H NMR和HR-TOF-MS對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法研究了目標(biāo)化合物對癌細(xì)胞及正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并進(jìn)一步對比了其與陽性藥物紫杉醇的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明：異海松基水楊酰腙對人體肝癌細(xì)胞HepG-2和前列腺癌細(xì)胞PC-3具有顯著的細(xì)胞毒性，半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別為6.50和9.25 μmol/L，高于或接近于對照物紫杉醇(IC5012.14和6.48 μmol/L)的細(xì)胞毒性，同時異海松基水楊酰腙對人體正常的肝細(xì)胞L-02具有較低的細(xì)胞毒性，IC50值為68.01 μmol/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照品紫杉醇(IC504.02 μmol/L)。抑制率和細(xì)胞形態(tài)變化分析表明，異海松基水楊酰腙對細(xì)胞增殖的抑制活性與劑量有關(guān)。

酰腙；異海松酸；異海松基水楊酰腙；細(xì)胞毒性

酰腙類化合物是一類特殊的席夫堿類化合物，具有較強的配位能力和多樣的配位方式，廣泛用于催化、生化反應(yīng)、分析試劑和螯合劑等方面。此外，酰腙類化合物因含有氮和氧原子，與生物環(huán)境接近，具有良好的抑菌[1]、抗癌[2-3]、抗病毒[4]、抗炎[5]和降壓[6]等生物活性，在醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域備受關(guān)注。關(guān)于水楊酰腙衍生物的生物活性研究報道較多，如鄰羧基苯甲醛水楊酰腙對大腸桿菌具有良好的抑菌活性[7]； 4-羥基-3-羧基苯甲醛水楊酰腙對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢菌的生長具有抑制作用[8]。水楊酰腙化合物也極易與金屬配位形成配合物，形成的配合物大多也具有良好的生物活性，如呋喃甲醛水楊酰腙稀土配合物對辣椒疫霉菌和煙草赤星菌有明顯的抑制活性[9]；銅(Ⅱ)與2-羰基丙酸水楊酰腙的配合物對辣椒疫霉菌具有100%的抑制作用，對煙草赤星菌有66%的抑制作用[10]。此類酰腙化合物是醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域極具潛力的生物活性藥物。近年來，將酰腙結(jié)構(gòu)引入到天然產(chǎn)物中來，開發(fā)新型、廣譜、高效、環(huán)保的生物活性制品引起了研究者們的極大興趣，相關(guān)的研究報道包括：根皮素異煙酰腙化合物表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性[11]，駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿類酰腙衍生物大多具有良好的抗煙草花葉病毒(TMV)活性[12]，蒎酸酰腙衍生物具有除草活性[13]，馬來松香酸酰腙化合物對多種植物病原菌具有顯著的抑制活性[14]，去氫樅酸羧基改性的酰腙衍生物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等表現(xiàn)出明顯的抑制活性[15]等等。本研究將天然松香中的一種重要的海松酸型樹脂酸——異海松酸，與水楊醛反應(yīng)合成了異海松基水楊酰腙，并對它的細(xì)胞毒性進(jìn)行了探討，為研究開發(fā)新的抗癌藥物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

異海松酸，根據(jù)文獻(xiàn)[16]方法自制；其他藥品和試劑均為市售化學(xué)純和分析純。人體肝癌細(xì)胞(HepG-2), 前列腺癌細(xì)胞(PC-3)和人體正常肝細(xì)胞(L-02)，紫杉醇，南京凱基生物有限公司。

Nicolet IS10傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力公司；WRS-1B型數(shù)字熔點儀(使用前溫度未經(jīng)校正)，上海申光儀器儀表有限公司；Bruker AV-300核磁共振波譜儀，美國Bruker公司；Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；XD-101型CO2培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；IX51生物倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

1.2 異海松基水楊酰腙的合成

1.2.1 異海松酰氯(1)的合成 在50 mL的三口燒瓶中加入1 g (3.3 mmol) 異海松酸(IPA)和5 mL 無水二氯甲烷，攪拌溶解。在N2保護下，向上述溶液中逐滴滴加0.34 mL(3.96 mmol)草酰氯和5 mL二氯甲烷(DCM)的混合溶液，滴加完畢后常溫反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸除溶劑和過量的草酰氯，得到淡黃色的異海松酰氯(1)。

1.2.2 異海松酰肼(2)的合成 將異海松酰氯(1)溶于5 mL四氫呋喃(THF)中，冰浴下緩慢滴加到含有0.18 mL(3 mmol)85 % 水合肼、0.5 mL(3.6 mmol)三乙胺和10 mL四氫呋喃的混合溶液中，滴加完畢，常溫反應(yīng)2 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束，過濾除去沉淀，濾液用去離子水洗滌3次，每次 20 mL，收集有機層，減壓除去溶劑，粗品用乙醇重結(jié)晶，得到白色固體異海松基酰肼(2)，得率76.2 %，熔點210.6～212.7 ℃。

1.2.3 異海松基水楊酰腙(3)的合成 0.95 g(3 mmol)異海松酰肼和0.32 mL(3 mmol)水楊醛在20 mL無水甲醇中，回流反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)。結(jié)束反應(yīng)后，將反應(yīng)液冷卻到室溫，減壓蒸除部分溶劑析出白色針狀結(jié)晶，粗品用甲醇重結(jié)晶，得白色針狀的異海松基水楊酰腙(3)。

合成反應(yīng)途徑如下：

1.3 細(xì)胞毒性測試

采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法[17]對異海松基水楊酰腙的細(xì)胞毒性進(jìn)行測試，并以紫杉醇為陽性對照。取對數(shù)生長期的人體癌細(xì)胞(HepG-2和PC-3)和人體正常肝細(xì)胞(L- 02)懸浮于含10%牛血清、10 mg/L青霉素和10 mg/L鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI-1640)培養(yǎng)液中，接種于96孔板中，每孔大約 3×104個細(xì)胞，于37 ℃，5% CO2下培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的供試化合物，各組設(shè)平行的3孔，同時設(shè)陰性對照組(生理鹽水)和陽性對照組(紫杉醇)。加藥后，96孔板繼續(xù)置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后每孔加入20 μL MTT(5 g/L)液進(jìn)行染色，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，每孔加入150 μL二甲亞砜(DMSO)，搖勻后，擇定每孔在490 nm處的吸光度(OD)值，按如下公式計算生長抑制率：抑制率=(1-實驗組OD/陰性對照組OD)× 100%。然后以各藥物濃度對數(shù)值對各種濃度下的抑制率做線性回歸曲線，從所得劑量-效應(yīng)方程計算出供試化合物對實驗細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

待測HepG-2細(xì)胞經(jīng)1.3節(jié)步驟中常規(guī)消化、傳代，給藥接種培養(yǎng)48 h后，置于倒置顯微鏡下放大100倍觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 異海松基水楊酰腙的結(jié)構(gòu)表征

2.2 對癌細(xì)胞及正常細(xì)胞增殖的抑制率分析

圖1 異海松基水楊酰腙對細(xì)胞增殖的抑制率Fig.1 Inhibitory rates of isopimaric-based salicylhydrazoneagainst human cancer and normal cells

考察了異海松基水楊酰腙(3)在3.13、 6.25、 12.50、 25.00、 50.00和100.00 μmol/L濃度下對兩種人體癌細(xì)胞(HepG-2和PC-3)和一種人體正常肝細(xì)胞(L-02)的抑制率，結(jié)果見圖1。由圖1可知，增殖抑制率隨著藥物濃度的增大而增強，且在3.13～50.00 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增大，藥物對細(xì)胞增殖抑制率增加的速度也較大，從50.00到100.00 μmol/L時，藥物對細(xì)胞增殖的抑制率變化較小，逐漸趨于平緩，說明異海松基水楊酰腙以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞的增殖。由圖1還可以看出，化合物3對兩種癌細(xì)胞的增殖抑制率明顯大于對正常細(xì)胞的增值抑制率，這說明化合物3對癌細(xì)胞具有顯著的毒性，而對正常細(xì)胞具有較低的毒性，也說明了化合物3對癌細(xì)胞具有更好的選擇性。對比化合物3對HepG-2和PC-3 細(xì)胞的增值抑制率可知，化合物3對HepG-2細(xì)胞的抑制作用更強。

2.3 細(xì)胞形態(tài)變化分析

HepG-2細(xì)胞經(jīng)異海松基水楊酰腙(3)處理48 h后，在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，如圖2所示。對照組細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)較規(guī)則的形狀，細(xì)胞排列密集連成片呈增殖狀態(tài)(圖2(a))。藥物處理后的細(xì)胞隨著給藥濃度的增大，細(xì)胞形態(tài)萎縮變形的程度也逐漸增大，給藥量6.25 μmol/L時，細(xì)胞數(shù)量和密度略微減少和降低，細(xì)胞形態(tài)不一，出現(xiàn)少部分長條形細(xì)胞(圖2(b))；在給藥量12.25 μmol/L時，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，密度也明顯降低，長條形細(xì)胞明顯增多(圖2(c))；給藥量25.00 μmol/L時，細(xì)胞密度更小，細(xì)胞之間空隙更大，基本看不到完整的細(xì)胞形態(tài)，絕大多數(shù)細(xì)胞裂解為碎片，產(chǎn)生凋亡小體(圖2(d))。由此，也說明化合物3以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞的增殖。

圖2 不同給藥濃度下HepG-2細(xì)胞形態(tài)的變化

2.4 對癌細(xì)胞及正常細(xì)胞的IC50值

異海松基水楊酰腙(3)對癌細(xì)胞及正常細(xì)胞的抑制率測試結(jié)果表明該化合物具有非常大的應(yīng)用價值，因此對比了其與紫杉醇對實驗細(xì)胞的IC50值，結(jié)果見表1。IC50值越大，說明化合物對細(xì)胞的毒性越

表1 異海松基水楊酰腙對HepG-2、PC-3和L-02的IC50值

?。籌C50值越小，則說明化合物對細(xì)胞的毒性越大。由表1可知，異海松基水楊酰腙對HepG-2、PC-3和L-02細(xì)胞的IC50值分別為6.50、9.25和68.01 μmol/L，也證實了上述對細(xì)胞抑制率的分析結(jié)果，即異海松基水楊酰腙對癌細(xì)胞具有更強的細(xì)胞毒性，對正常細(xì)胞的毒性較小。另外，異海松基水楊酰腙對HepG-2癌細(xì)胞的IC50值低于紫杉醇的IC50值(12.14 μmol/L)，說明異海松基水楊酰腙對HepG-2細(xì)胞的抗癌活性高于紫杉醇的抗癌活性；而異海松基水楊酰腙對PC-3癌細(xì)胞的IC50值略高于紫杉醇的IC50值(6.48 μmol/L)，說明異海松基水楊酰腙對PC-3細(xì)胞的抗癌活性略低于紫杉醇，但已經(jīng)很接近紫杉醇了。從表1中也發(fā)現(xiàn)，紫杉醇對正常細(xì)胞L-02的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于異海松基水楊酰腙對L-02的細(xì)胞毒性(約45倍)。據(jù)此分析，可以適當(dāng)提高異海松基水楊酰腙的用量約1.5倍于紫杉醇的量則就可以達(dá)到紫杉醇對PC-3的抑制效果，且不至于對正常細(xì)胞造成很大毒性。綜上分析，異海松基水楊酰腙是一種非常有潛力的抗癌藥物。

3 結(jié) 論

3.1 以異海松酸和水楊醛為原料，合成了異海松基水楊酰腙(3)，并通過IR、1H NMR和HRMS鑒定結(jié)構(gòu)，確定合成了目標(biāo)產(chǎn)物。

3.2 采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法對比了化合物3對人體癌細(xì)胞HepG-2和PC-3及人體正常細(xì)胞L- 02增殖的抑制作用。隨著濃度增大，化合物3對細(xì)胞的增值抑制率變大，表明化合物的細(xì)胞毒性與其劑量有關(guān)；利用倒置顯微鏡對不同給藥量下細(xì)胞的形態(tài)變化進(jìn)行了觀察，細(xì)胞萎縮變形程度隨給藥量增大而增大，也表明了化合物3對細(xì)胞的抑制作用與其劑量有關(guān)。

3.3 通過對化合物3抑制細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)值的分析表明：化合物3對兩種癌細(xì)胞HepG-2和PC-3都表現(xiàn)出顯著的抑制活性，IC50分別為6.50和9.25 μmol/L，對HepG-2的IC50高于對照物紫杉醇(IC5012.14 μmol/L)，對PC-3的IC50接近于紫杉醇(IC506.48 μmol/L)；而對正常細(xì)胞L-02具有較低的細(xì)胞毒性，表明3是一種具有應(yīng)用前景的抗癌候選化合物。

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Synthesis and Cytotoxicity of Isopimaric-based Salicyloylhydrazone

LIU Juanjuan1, LU Yanju1,2, CHEN Yuxiang1,2, ZHAO Zhendong1,2

(1.Institute of Chemical Industry of Forest Product,CAF;National Engineering Lab. for Biomass Chemical Utilization;Key and Open Lab. of Forest Chemical Engineering,SFA;Key Lab. of Biomass Energy and Material,Jiangsu Province,Nanjing 210042, China; 2.Research Institute of Forestry New Technology,CAF, Beijing 100091, China)

Isopimaric-based salicylhydrazone was synthesized by the reaction of isopimaric acid (IPA) and salicylaldehyde, and characterized by IR,1H NMR and HRMS. The cytotoxicities of target compound were evaluated against two human cancer cells (hepatoma cell HepG-2 and prostatic carcinoma cell PC-3) and a human normal liver cell L-02invitrousing MTT method, which were compared with that of the positive drug taxol. The results showed that cytotoxic activity of isopimaric-based salicylhydrazone was similar or higher than that of taxol (IC50, 12.14 and 6.48 μmol/L) against HepG-2 and PC-3 cell lines, with IC50values 6.50 and 9.25 μmol/L, respectively. Moreover, isopimaric-based salicylhydrazone displayed hypotoxicity to L- 02 cell, with IC50value 68.01 μmol/L, which was much lower than that of taxol (IC50, 4.02 μmol/L). The inhibitory rates and cell morphological changes showed that isopimaric-based salicylhydrazone significantly inhibited the cell proliferation in a dose-dependent manner.

acylhydrazone; isopimaric acid; isopimaric-based salicyloylhydrazone; cytotoxic

2016- 11- 25

中國林科院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(CAFYBB2017QA018)；國家自然科學(xué)基金資助項目(31370575)

劉娟娟 (1984— ), 女，安徽阜陽人，博士生，從事萜類化學(xué)利用的研究

*通訊作者：趙振東，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物利用，應(yīng)用化學(xué)等領(lǐng)域的研究；E-mail: zdzhao@189.cn。

10.3969/j.issn.0253-2417.2017.04.005

TQ351

A

0253-2417(2017)04-0035-05

劉娟娟，盧言菊，陳玉湘，等.異海松基水楊酰腙的合成及細(xì)胞毒性評價[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2017，37(4)：35-39.