蔡克瑞 劉志新 孫曉冬 梁 軍 閆 磊

(牡丹江醫(yī)學(xué)院組胚教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

緩激肽對(duì)體外培養(yǎng)大鼠血視網(wǎng)膜屏障通透性的影響

蔡克瑞 劉志新 孫曉冬 梁 軍 閆 磊

(牡丹江醫(yī)學(xué)院組胚教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

目的探討緩激肽對(duì)體外培養(yǎng)大鼠血視網(wǎng)膜屏障通透性的影響。方法將緩激肽作用于Transwell小室建立體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(REVC)間緊密連接屏障模型，通過(guò)跨上皮細(xì)胞電阻(TER)值觀察緩激肽對(duì)大鼠REVC間緊密連接結(jié)構(gòu)的影響；RT-PCR 法檢測(cè)緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組作用2 h的TER值小于測(cè)量前、作用4 h組和對(duì)照組(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組作用4 h組和測(cè)量前、對(duì)照組TER值無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)論緩激肽可在轉(zhuǎn)錄水平上減少緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin mRNA表達(dá)，能夠開放大鼠REVC間的緊密連接，增加血視網(wǎng)膜屏障的通透性。

緩激肽；視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞；緊密鏈接

血視網(wǎng)膜屏障是機(jī)體維持眼內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)之一，可以選擇性濾過(guò)血液中的有用物質(zhì)。這種功能在維持眼內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的同時(shí)，也限制藥物向眼內(nèi)組織傳遞，從而嚴(yán)重影響療效。血視網(wǎng)膜屏障也是藥物治療糖尿病所致視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈阻塞等眼底疾病的主要制約因素。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(REVC)在各種眼底病發(fā)病中都起著關(guān)鍵作用，本研究利用Transwell小室建立體外培養(yǎng)的大鼠REVC間緊密連接屏障模型，觀察緩激肽對(duì)大鼠血視網(wǎng)膜屏障通透性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SPF 級(jí)大鼠30只，質(zhì)量80～110 g，雌雄不限(牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。DMEM/F12培養(yǎng)基、D-Hank液(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體(美國(guó)Sigma公司)；24孔板Transwell小室，膜孔徑0.4 μm(美國(guó)Millipore公司)，Millicell-ERS 電阻測(cè)量?jī)x(美國(guó)Millipore公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠REVC的獲取和細(xì)胞培養(yǎng) 取SPF級(jí)大鼠1只，過(guò)量麻醉處死，無(wú)菌下在赤道部剪開眼球，去除眼前節(jié)及玻璃體，用眼科剪小心分離視網(wǎng)膜，用2%胰蛋白酶室溫消化視網(wǎng)膜30 min,邊消化邊吹打視網(wǎng)膜,取出殘留的視網(wǎng)膜,除去可見的大血管后剪碎、勻漿,濾網(wǎng)過(guò)濾(孔徑100 μm),用0.1%Ⅱ型膠原酶消化30 min,加入含有體積分?jǐn)?shù)20%的胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞。加入含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液，滴加重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，置于5%CO2自動(dòng)調(diào)節(jié)保溫箱培養(yǎng)(37℃)，每2～3 d換液，不斷洗去崩解的視網(wǎng)膜碎片及死亡的其他細(xì)胞,待細(xì)胞匯合單細(xì)胞層后,按1∶2傳代。

1.2.2大鼠REVC的鑒定 將蓋玻片放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)消化細(xì)胞，37℃孵育24 h，待細(xì)胞爬滿后取出，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，用冷丙酮固定10 min，PBS漂洗細(xì)胞，加入第Ⅷ 因子相關(guān)抗原抗體，另外細(xì)胞加入PBS作陰性對(duì)照，37℃孵育1 h，用PBS漂洗3次，卵白素-生物素-酶復(fù)合物(SABC)法染色，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)/H2O2顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.3體外培養(yǎng)的大鼠REVC間緊密連接屏障模型的建立 取培養(yǎng)的大鼠REVC經(jīng)2.5 g/L胰酶消化后，以5×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于鋪有層黏連蛋白的Transwell小室中，上室加入400 μl細(xì)胞懸液，下室加入600 μl培養(yǎng)液，接種后第1天及之后每周換液2次，所用培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。

1.2.4緩激肽對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠REVC間緊密連接屏障模型的影響 將在Transwell小室中培養(yǎng)15 d以后的大鼠REVC作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組；加入含緩激肽的DMEM/F12培養(yǎng)液，使緩激肽作用時(shí)間分別為2 h和4 h。作用相應(yīng)時(shí)間后，用跨上皮細(xì)胞電阻測(cè)定儀(EVOM)測(cè)定跨上皮細(xì)胞電阻(TER)值，單位為Ω×cm2，最終測(cè)量值為膜連同大鼠REVC的電阻值減去背景電阻值，每一孔電阻的測(cè)量至少重復(fù)3次，每一時(shí)間點(diǎn)至少用不同的3個(gè)孔進(jìn)行測(cè)量。

1.2.5RT-PCR 法檢測(cè)緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin 和ZO-1 mRNA的表達(dá) 設(shè)計(jì)引物，ZO-1上游引物：5'-TGCTATTACACGGTCCTC-3'，下游引物5'-TGGTGCTCCTAAACAATC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為191 bp。occludin上游引物：5'-GACCACTATGAAACCGACTA-3'，下游引物：5'-CTCACTTCTCCAGCAACC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為411 bp。β-actin上游引物：5'-AGCCATGTACGTTAGCCATCC-3'，下游引物:5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，產(chǎn)物228 bp。分別對(duì)兩組采用Trizol試劑一步法提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)參數(shù)：94℃ 5 min，94℃ 30 s，62℃ 45 s，72℃ 30 s，共31個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照，用Bio-Rad 凝膠成像儀成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并分析結(jié)果。以β-actin為內(nèi)參照行半定量分析。相對(duì)含量測(cè)定：用美國(guó) Bio-Rad Gep doc 2000 凝聚膠成像分析系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度掃描并用Quantity One軟件計(jì)算ZO-1/β-actin、occludin/β-actin的比值表示其相對(duì)含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠REVC的原代培養(yǎng)形態(tài) 倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的大鼠REVC生長(zhǎng)情況。分離的大鼠REVC一般在24 h后貼壁,逐漸形成細(xì)胞團(tuán),細(xì)胞呈梭形,第3～5天細(xì)胞克隆樣生長(zhǎng)。12～15 d可呈鋪路石狀鋪滿培養(yǎng)皿成單層融合,存在明顯的接觸抑制。傳代細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，5～7 d即可融合生長(zhǎng)。見圖1。

2.2大鼠REVC的免疫組化鑒定 大鼠REVC對(duì)Ⅷ因子相關(guān)抗體染色陽(yáng)性，空白對(duì)照組則呈陰性。見圖2。

圖1 大鼠REVC原代培養(yǎng)24 h倒置顯微鏡下改變

圖2 大鼠REVC對(duì)Ⅷ因子相關(guān)抗體染色陽(yáng)性改變

2.3緩激肽對(duì)體外培養(yǎng)大鼠REVC間緊密連接屏障模型的影響 加入緩激肽的大鼠REVC間緊密連接屏障模型不同時(shí)間點(diǎn)的TER值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.25，P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組作用2 h的TER值(170.61±2.51)小于測(cè)量前(310.29±1.53)、4 h(298.35±2.86)和對(duì)照組(觀量前300.16±5.19，作用2 h 298.34±5.88，作用4 h 300.34±5.43)(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組作用4 h、測(cè)量前和對(duì)照組無(wú)明顯變化(P>0.05)。

2.4RT-PCR 法檢測(cè)緩激肽對(duì)緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin mRNA表達(dá)的影響 見圖3，表1。實(shí)驗(yàn)組作用2 h,ZO-1和occludin mRNA值小于測(cè)量前、4 h和對(duì)照組(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組作用4 h、測(cè)量前和對(duì)照組無(wú)明顯變化(P>0.05)。

圖3 RT-PCR檢測(cè)ZO-1和occludin mRNA表達(dá)

表1 緩激肽對(duì)ZO-1和occludin mRNA表達(dá)的影響(±s,n=10)

與實(shí)驗(yàn)組2 h比較：1)P<0.01

3 討 論

血視網(wǎng)膜屏障由相鄰的REVC之間的緊密連接、周膜細(xì)胞及其之間的基膜組成，星形膠質(zhì)細(xì)胞及Müller細(xì)胞的突起包繞其外，緊密連接是維持血視網(wǎng)膜屏障完整的基礎(chǔ)〔1〕。緩激肽是自然存在于體內(nèi)的小分子九肽，是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中一種主要的激肽類物質(zhì)，既可引起病理生理反應(yīng)，又可發(fā)揮生理保護(hù)作用，參與多系統(tǒng)器官的功能調(diào)節(jié)和病理生理過(guò)程，如心血管、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖、平滑肌收縮、炎癥、疼痛、休克和組織損傷過(guò)程〔2〕。目前，緩激肽開放屏障的功能已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn)。Inamura等〔3〕在1994年首先發(fā)現(xiàn)小劑量緩激肽可以選擇性開放血腫瘤屏障。劉麗波等〔4〕發(fā)現(xiàn)緩激肽可以開放腦膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障的緊密連接，增加血腫瘤屏障的通透性。王玉勤等〔5〕發(fā)現(xiàn)小劑量緩激肽可以通過(guò)開放緊密連接增加大鼠缺血區(qū)血腦屏障的通透性。Easton等〔6〕研究表明緩激肽可通過(guò)B2受體結(jié)合，引起Ca2+釋放增加，從而激活磷脂酶A2和5-脂氧化酶，促進(jìn)花生四烯酸的代謝，降低跨內(nèi)皮細(xì)胞阻抗，開放血腦屏障的緊密連接。

目前針對(duì)緩激肽是否可以開放血視網(wǎng)膜屏障的研究還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，給予緩激肽后，緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin mRNA表達(dá)減少，大鼠血視網(wǎng)膜屏障的通透性升高，證明緩激肽具有開放血視網(wǎng)膜屏障的功能。緩激肽開放血視網(wǎng)膜屏障的機(jī)制還不明確。緊密連接在結(jié)構(gòu)上是一組蛋白原件構(gòu)成的復(fù)合體，主要包括：①跨膜蛋白，主要由occludins，claudins，junction associated molecules等蛋白家族組成；②胞質(zhì)附屬蛋白，主要包括ZO-1，ZO-2，ZO-3，7H6等蛋白家族。細(xì)胞骨架蛋白F-actin是緊密連接形成胞旁屏障的重要因素，其幾乎存在于每一處緊密連接的細(xì)胞膜上，用細(xì)胞松弛素破壞細(xì)胞骨架蛋白F-actin 亦可導(dǎo)致緊密連接的破壞。ZO-1是1986年發(fā)現(xiàn)的與緊密連接相關(guān)的蛋白，是構(gòu)成緊密連接的重要成分之一,能與其同源體ZO-2、ZO-3一起,為緊密連接的許多跨膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)緊密連接蛋白搭建具有連接作用的腳手架樣平臺(tái)〔6〕。occludin是第一個(gè)被分離出來(lái)的緊密連接跨膜蛋白，由504個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為6.5×104。occludin中長(zhǎng)的C端富含絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基與ZO-1的PDZ結(jié)構(gòu)域相連，依次和肌動(dòng)蛋白骨架細(xì)胞相連。緊密連接相關(guān)蛋白彼此之間存在相互作用，維持緊密連接的完整性。而且，如果這些蛋白發(fā)生紊亂將會(huì)直接影響緊密連接的完整性，進(jìn)而改變屏障的通透性。劉坤〔7〕發(fā)現(xiàn)緩激肽與罌粟堿伍用可以通過(guò)減少緊密連接相關(guān)蛋白claudin-5表達(dá)，增加血腫瘤屏障的通透性。劉麗波等〔8〕發(fā)現(xiàn)緩激肽可在轉(zhuǎn)錄水平上減少緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin 和ZO-1 的表達(dá)，開放血腫瘤屏障。血視網(wǎng)膜屏障的超微結(jié)構(gòu)與血腦屏障和血腫瘤屏障具有一定的相似性。因此認(rèn)為，緩激肽開放血視網(wǎng)膜屏障、增加血視網(wǎng)膜屏障的通透性的機(jī)制，可能與在轉(zhuǎn)錄水平上減少緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin mRNA的表達(dá)水平、降低緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的表達(dá)有關(guān)。

1宋昊剛，崔 浩.血-眼屏障的作用及意義〔J〕.航空航天醫(yī)學(xué),2005;16(2):53-4.

2Ongali B，Hellal F，Rodi D，etal.Autoradiographic analysis of mouse brain kinin B1 and B2 receptors after closed head trauma and ability of Anatibant mesylate to cross the blood-brain barrier〔J〕.J Neurotrauma,2006;23(5):696-707.

3Inamura T，Black KL.Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,1994;14(5):862-70.

4劉麗波，楊智舫，劉 麗，等.緩激肽對(duì)腦膠質(zhì)瘤大鼠緊密連接影響的形態(tài)學(xué)觀察〔J〕.解剖科學(xué)進(jìn)展，2007;13(3):226-9.

5王玉勤，安 平，薛一雪.緩激肽對(duì)大鼠缺血區(qū)血腦屏障的影響〔J〕.解剖科學(xué)進(jìn)展，2005;11(2):95-8.

6Easton AS，Abbott NJ.Bradykinin increases permeability by calcium and 5-lipoxygenase in the ECV304/C6 cell culture model of the blood-brain barrier〔J〕.Brain Res,2002;953(2):157-69.

7劉 坤.緊密連接相關(guān)蛋白claudin-5在緩激肽與罌粟堿伍用開放血腫瘤屏障中的作用〔D〕.沈陽(yáng)：中國(guó)醫(yī)科大學(xué),2008.

8劉麗波，薛一雪，王 萍.緩激肽對(duì)腦膠質(zhì)瘤大鼠occludin和ZO-1 mRNA的調(diào)節(jié)和機(jī)制〔J〕.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010;39(7):497-500.

〔2017-03-21修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.H2015078)

閆 磊(1978-)，男，講師，主要從事干細(xì)胞增殖與分化研究。

蔡克瑞(1980-)，女，講師，主要從事衰老生物機(jī)制及中藥抗衰老研究。

R329.2；R774.1

A

1005-9202(2017)16-3925-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.007