鐘雪梅 林一民 李倩倩 鄧世山 邵如月 丁 浩

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)院，重慶 401331)

siRNA干擾膜聯(lián)蛋白A1基因?qū)谞钕偃轭^狀癌TPC-1細(xì)胞增殖的影響

鐘雪梅 林一民1李倩倩2鄧世山2邵如月 丁 浩

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)院，重慶 401331)

目的通過小干擾RNA(siRNA)干擾膜聯(lián)蛋白(ANX)A1基因在甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中的表達(dá)，探討ANXA1對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法設(shè)計并篩選使用高效的siRNA在甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞株中特異性干擾ANXA1的表達(dá)，然后用CCK8法觀察ANXA1干擾后對TPC-1細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果篩選的siRNA可高效沉默ANXA1在TPC-1細(xì)胞中的表達(dá)，顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌的增殖。結(jié)論siRNA干擾ANXA1表達(dá)，可抑制甲狀腺乳頭狀癌的增殖，提示ANXA1可能是甲狀腺乳頭狀癌治療的一個重要的生物學(xué)靶標(biāo)。

甲狀腺乳頭狀癌；膜聯(lián)蛋白A1；TPC-1細(xì)胞；小分子干擾RNA

膜聯(lián)蛋白(ANX) 是一類高豐度蛋白，有鈣依賴性，且能夠和帶負(fù)電荷膜磷脂結(jié)合的一種蛋白超家族〔1〕。ANXA1作為ANX家族重要成員之一，參與細(xì)胞的各種生理病理過程〔2〕。研究還發(fā)現(xiàn)，ANXA1與腫瘤關(guān)系非常密切，在很多腫瘤中表達(dá)異常且參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、細(xì)胞信號和轉(zhuǎn)導(dǎo)以及侵襲等過程，這可能與ANXA1 高度依賴鈣磷脂結(jié)合蛋白，很多位點可生物再加工，包括被酪氨酸激酶磷酸化、糖基化、乙酰化、磷酸化，增加水解作用，促進(jìn)重要分子的增殖有關(guān)〔3，4〕。甲狀腺癌(TC) 是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見腫瘤，它的病理分型有甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺髓樣癌、未分化癌和甲狀腺濾泡狀癌，其中PTC惡性程度較甲狀腺癌其他分化類型低，它的發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素導(dǎo)致的，診治較困難，且易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)〔5〕。過度診治可給患者帶來身心傷害和負(fù)擔(dān)，其中手術(shù)導(dǎo)致的喉返神經(jīng)損傷引起發(fā)聲費(fèi)力、呼吸困難甚至窒息等是甲狀腺手術(shù)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。本文擬探索一種新的標(biāo)記物和治療方法，提高PTC的診治，改善PTC患者的生活質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 將從深圳百恩維生物公司購買的人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1，在細(xì)胞生長90%匯合時進(jìn)行細(xì)胞傳代，加入含10%～15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，5%CO2、37℃恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)試驗需要進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)以及細(xì)胞的凍存復(fù)蘇。

1.2ANXA1 siRNA設(shè)計 從GenBank中檢索出人ANXA1全長序列，遵循引物設(shè)計原則，使用Version2.0軟件設(shè)計出針對ANXA1基因的特異性片段3對及無關(guān)序列siRNA片段(NCsiRNA)1對。以上siRNA由廣州銳博生物科技有限公司復(fù)核并合成。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h接種6孔板，將甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞以(2.5～5)×105/孔的密度接種，使其生長至80%或剛好鋪滿培養(yǎng)板且處于對數(shù)生長期進(jìn)行轉(zhuǎn)染。選擇細(xì)胞傳代在5代以內(nèi)的轉(zhuǎn)染，根據(jù)Lipofectamine(lip)2000(Invitrogen美國)說明書操作，將帶有熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染至TPC-1細(xì)胞內(nèi)。實驗分空白組(不轉(zhuǎn)染)，實驗組(三對分別轉(zhuǎn)染siRNA)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染NCsiRNA)及脂質(zhì)體組，其中實驗組包括ANXA1-siRNA1組、ANXA1-siRNA2組、ANXA1-siRNA3組。操作步驟：稀釋siRNA，用250 μl無血清培養(yǎng)基稀釋5 μl 的siRNA，輕輕混勻。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑：用250 μl無血清培養(yǎng)基加入lip2000脂質(zhì)體5 μl；將稀釋后的siRNA和脂質(zhì)體lip2000混勻，即每個EP管共510 μl混合液，在室溫下孵育15～20 min；將6孔板培養(yǎng)的生長狀態(tài)良好的細(xì)胞移至超凈臺，先吸出舊培養(yǎng)基，用PBS輕柔洗滌3次，加入1 490 μl無血清培養(yǎng)基；將孵育好的siRNA和lip2000脂質(zhì)體510 μl加入6孔板中，每孔終體積為2 ml。轉(zhuǎn)染前后避光，于5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)。6 h后換成含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 先提取細(xì)胞總RNA，并鑒定在RNA的完整性。GenBank中檢索出人ANXA1和β-actin全長序列，用 Oligo6 軟件分別設(shè)計引物，以β-actin為內(nèi)參對照，ANXA1基因上游引物：5′-gTCATCCAAAggTggTCCCg-3′，下游引物：5′-CgCTgTgCATTgTTTCgCTTA-3′，產(chǎn)物大小為153 bp；β-actin上游引物：5′-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′，下游引物：5′-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3′，產(chǎn)物大小為594 bp。將逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。ANXA1及β-actin基因的上下游引物和通過半定量RT-PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物marker在1.0%～1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，溴酚藍(lán)染色，凝膠成像系統(tǒng)上觀察擴(kuò)增的條帶并采集圖片，測量灰度值，計算mRNA相對表達(dá)量，用圖像分析軟件PDQuest進(jìn)行分析。

1.5CCK-8檢測細(xì)胞活力 CCK-8實驗步驟按說明書操作：將TPC-1 細(xì)胞以密度(2～2.5)×103/個接種于96孔板，每孔終體積為100～200 μl，分別為ANXA1-siRNA3組、空白組、negative-siRNA組，每組設(shè)置8個復(fù)孔，待細(xì)胞鋪滿70%～80%時轉(zhuǎn)染。分別在轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h每孔加入CCK-8試劑10 μl，避光置于37℃孵箱中繼續(xù)培育孵育，時間的長短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度不同而不同，TPC-1細(xì)胞分別在0.5、1、2、4 h用酶標(biāo)儀檢測，孵育1 h后細(xì)胞顏色最深，增殖最多。用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的吸光度(A)值，并根據(jù)A值分析細(xì)胞活力狀況。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1熒光顯微鏡下觀察TPC-1細(xì)胞表達(dá) ANXA1-siRNA和negative-siRNA在48 h時轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上，轉(zhuǎn)染效率最好。見圖1。

2.2各組TPC-1細(xì)胞中ANXA1 mRNA水平比較 各ANXA1-siRNA干擾組siRNA1、siRNA2、siRNA3 mRNA表達(dá)水平分別是0.51±0.11、 0.49±0.08、0.41±0.14，空白組、脂質(zhì)體組及陰性對照組的mRNA表達(dá)水平為1.34±0.17、1.15±0.098、1.25±0.175 。ANXA1-siRNA干擾組mRNA表達(dá)水平較其他組明顯下降(P<0.05)，其中ANXA1-siRNA3下降最明顯；而空白組、脂質(zhì)體組及陰性對照組的mRNA表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。

2.3siRNA干擾ANXA1基因后對TPC-1細(xì)胞活力的影響 在轉(zhuǎn)染后的不同時間點，空白組及negative-siRNA組比較細(xì)胞增殖無明顯差異(P>0.05)；而轉(zhuǎn)染48、72、96 h后，ANXA1-siRNA3組細(xì)胞增殖低于空白組及negative-siRNA組(P<0.05)，見表1。

表1 不同轉(zhuǎn)染時間段各組細(xì)胞的OD值(±s)

與空白組比較：1)P<0.05;與negative-siRNA組比較：2)P<0.05

圖1 熒光顯微鏡下觀察TPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后圖像(×10)

3 討 論

siRNA由21～25個核苷酸組成，能引起RNA沉寂和抑制靶蛋白的表達(dá)。由于siRNA能夠高效、快速地敲除基因的表達(dá)，對很多疾病(如腫瘤、基因疾病、病毒性干擾等)具有極好的治療前景。本實驗前期的研究中發(fā)現(xiàn)，ANXA1蛋白在PTC組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中高表達(dá)，在癌旁正常組織中低表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小相關(guān)〔6～8〕。靶向治療已經(jīng)運(yùn)用與臨床，并顯示出很好的治療前景。這為PTC的研究提供了很好的著眼點，抑制ANXA1基因功能是否影響PTC的生物學(xué)特性成為本次的研究目的。

本研究結(jié)果顯示，設(shè)計并合成的siRNA在mRNA水平顯著抑制了ANXA1的表達(dá)，具有高效性和專一性，進(jìn)而利用篩選的效率最高的siRNA進(jìn)行后續(xù)研究。siRNA顯著干擾了ANXA1蛋白的表達(dá)，抑制了甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞株的增殖能力，提示ANXA1在PTC中可能是一個癌基因。ANXA1屬于Ca2+的受體蛋白，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)磷酸化和磷脂代謝等一些信號蛋白功能失常時，細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的信息發(fā)生改變，研究推斷 ANXA1可能通過各種信號途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用〔9〕。 ANXA1在癌組織中高表達(dá)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的能力，并有抗癌細(xì)胞凋亡的作用。這為PTC的臨床治療提供了新思路，即通過靶向治療抑制ANXA1蛋白高表達(dá)，從而達(dá)到控制腫瘤的作用。目前，關(guān)于ANXA1研究已成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點。如Babbin 等〔10〕也發(fā)現(xiàn)ANXA1在結(jié)腸癌表達(dá)上調(diào)，運(yùn)用高表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞系 SKCO-15，用 siRNA 敲低ANXA1 的表達(dá)，顯示其能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞系SKCO-15的增殖，且降低結(jié)直腸癌細(xì)胞系 SKCO-15的侵襲能力?？傊?，ANXA1通過多種方式參與信號通路和酶的表達(dá)，具體機(jī)制待深入探討。

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10Babbin BA，Lee WY，Parkos CA，etal.AnnexinA1 regulates SKCO-15 cell invasion by signaling through formyl peptide receptors〔J〕.J Biol Chem，2006；281(28)：19588-99.

〔2016-12-15修回〕

(編輯 李相軍)

InflunenceofsiRNAinterferingANXA1expressiononcytobiologicalcharacteristicspapillarythyroidcarcinomaTPC-1cells

ZHONGXue-Mei,LINYi-Min,LIQian-Qian,etal.

ChongqingMedicalandPharmaceuticalCollege,Chongqing401331,China

ObjectiveTo investigate the effects of ANXA1 on the cytobiological of papillary thyroid carcinoma cells by small RNA(siRNA)knock-down the ANXA1 expression in the papillary thyroid carcinoma TPC-1 cells.MethodsThe designed highly efficient siRNA was used to conduct the specific interference on ANXA1 expression in the papillary thyroid carcinoma TPC-1 cells.Then the influence on the papillary thyroid carcinoma cells proliferation was observed by CCK-8 method.ResultsThe designed siRAN efficiently inhibited the expression of ANXA1 mRNA in papillary thyroid carcinoma cells; furthermore, markedly suppressed the proliferation of papillary thyroid carcinoma cells.ConclusionsThe siRNA interfering ANXA1 could inhibit the proliferation of papillary thyroid carcinoma cells.

Papillary thyroid carcinoma；ANXA1；TPC-1 cells；siRNA

國家自然科學(xué)基金資助項目(No：81172496)

林一民(1965-)，女，主任技師，主要從事臨床血液體液檢驗工作。

鐘雪梅(1980-)，女，碩士，主要從事內(nèi)分泌基礎(chǔ)與臨床研究。

R735.+1

A

1005-9202(2017)16-3920-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.005

1 重慶市腫瘤研究所 2 川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院