吳 林 唐 農(nóng) 麻小梅 陳 煒 鄭?？?趙海濤 白碩宇 曾冬娟 楊惠丹 鄧 燕

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

溫肺降濁方對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及Caspase-3蛋白表達的影響

吳 林 唐 農(nóng) 麻小梅 陳 煒1鄭?？?趙海濤 白碩宇 曾冬娟 楊惠丹 鄧 燕

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

目的研究溫肺降濁方對血管性癡呆(VD)大鼠學(xué)習(xí)記憶及Caspase-3蛋白表達的影響。方法雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法制做VD模型大鼠，將造模成功的大鼠隨機分為模型組，低、中、高劑量溫肺降濁方組及石杉堿甲組，另設(shè)假手術(shù)組。灌胃給予相應(yīng)藥物治療，連續(xù)給藥30 d后，用Morris水迷宮檢測學(xué)習(xí)記憶能力，HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的改變，Western印跡檢測海馬組織Caspase-3的表達。結(jié)果Morris水迷宮檢測結(jié)果，溫肺降濁方各組平均逃避潛伏期明顯低于模型組(P<0.01)，找到平臺的次數(shù)較模型組明顯增多(P<0.01)。HE染色結(jié)果表明，溫肺降濁方各組能夠不同程度地改善海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)異常。Western印跡實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫肺降濁方各組大鼠海馬組織Caspase-3的表達明顯低于模型組(P<0.01)。結(jié)論溫肺降濁方可通過抑制Caspase-3的表達，改善VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)異常，從而改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

溫肺降濁方；血管性癡呆；學(xué)習(xí)記憶；Caspase-3

目前血管性癡呆(VD)的發(fā)病機制尚不清楚，在發(fā)達國家中VD占全部癡呆患者的25%～50%，成為導(dǎo)致癡呆的第二大原因〔1〕。Caspase-3作為Caspase家族中的一員，是凋亡的關(guān)鍵酶，在細胞凋亡過程中處于核心位置，它最終使細胞凋亡能夠精確、完整的實施，而海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的大量凋亡丟失，可引起學(xué)習(xí)記憶障礙，導(dǎo)致VD。本實驗擬觀察溫肺降濁方對VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)、Caspase-3蛋白表達。

1 材料與方法

1.1動物、設(shè)備及試劑 3月齡，健康雄性SPF級SD大鼠120只，體重(200±50)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供(許可證號：SCXK桂2009-0002)。由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)的WMT-100型Morris水迷宮設(shè)備全套，德國萊卡生產(chǎn)的RM2015型全自動石蠟切片機，日本奧林巴斯公司生產(chǎn)的CX-31型電子顯微鏡，美國Media Cybernetics公司生產(chǎn)的多功能圖像分析管理系統(tǒng)，美國Thermo公司生產(chǎn)的CA91786型 UVP凝膠成像系統(tǒng)，蘇木素(北京中杉金橋公司生產(chǎn)，批號：ZLI-9608)，伊紅(北京中杉金橋公司生產(chǎn)，批號：ZLI-9612)，Caspase-3抗體(美國Cell Signaling Technology公司生產(chǎn)，批號：9665S)。溫肺降濁方，由制附子20 g，黨參15 g，炙甘草10 g，干姜10 g，酒大黃10 g，田七10 g共6味中藥組成，由我院藥劑科統(tǒng)一采購，同比轉(zhuǎn)為中藥免煎顆粒劑(由江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司提供，批號：1406033)的用量，灌胃時給予溫肺降濁方免煎顆粒劑。石杉堿甲片(浙江震元制藥有限公司生產(chǎn)，批號：H20033718)。頭孢羥氨芐甲氧芐啶膠囊(哈藥集團三精制藥諾捷有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號：H20056737)，用于造模術(shù)后預(yù)防感染。

1.2VD模型制備 隨機從合格的大鼠抽出16只作為假手術(shù)組，其余104只大鼠進行VD模型大鼠的制備。參照Ni等〔2〕的雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎(2-VO)法將大鼠雙側(cè)頸總動脈用4-0無菌蠶絲線永久性結(jié)扎制作VD動物模型。假手術(shù)組腹腔注射麻醉后行分離雙側(cè)頸總動脈手術(shù)操作，但不結(jié)扎，其余操作及術(shù)后處理與模型組相同，以減少手術(shù)造成的誤差。

1.3Morris水迷宮實驗 定位航行實驗：設(shè)計大鼠進駐平臺的時間(逃避潛伏期時間)為60s，然后將各組大鼠按第1、2、3、4象限的順序，將大鼠面向池壁(大鼠頭部向上，以防溺水)依次放入水中，記錄其60 s內(nèi)成功進駐平臺(大鼠找到平臺并滯留其上5 s為成功)所需時間(即逃避潛伏期)。如果大鼠在60 s內(nèi)找不到平臺，系統(tǒng)則自動停止記錄，此時實驗者則引導(dǎo)其到平臺的位置，讓它在平臺上停留10 s再取出來，且記錄大鼠逃避潛伏期時間為60 s。每只大鼠每天訓(xùn)練4次(上、下午各2次)，連續(xù)5 d。取第5天中4個象限逃避潛伏期時間的均數(shù)作為學(xué)習(xí)成績的檢測指標(biāo)?？臻g搜索實驗：在完成定位航行實驗后撤走平臺，即水迷宮實驗第6天開始進行空間搜索實驗。實驗時間設(shè)置為60 s，將大鼠依次從4個象限放入水中，記錄所有大鼠經(jīng)過原先平臺位置的次數(shù)，測試大鼠對原平臺的記憶，取4個象限跨越平臺次數(shù)的均數(shù)作為記憶成績的檢測指標(biāo)。

1.4造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn) 參照趙憲林等〔3〕的VD模型大鼠篩選標(biāo)準(zhǔn)進行判定，即以假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期時間的均值為參考值，計算模型組大鼠各鼠的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間的比例，該值>20%定為合格的VD大鼠。本次實驗中104只大鼠經(jīng)2-VO法造模后有82只大鼠存活，此82只大鼠經(jīng)過篩選后，結(jié)果有75只大鼠為合格的VD模型大鼠。

1.5實驗分組 根據(jù)隨機數(shù)字表，將合格的75只VD模型大鼠隨機分到5個組，即模型組15只，低劑量溫肺降濁方組15只，中劑量溫肺降濁方組15只，高劑量溫肺降濁方組15只，石杉堿甲組15只。

1.6灌胃給藥 于造模后第15天開始灌胃給藥，大鼠灌胃藥物劑量的換算方法，均按人與大鼠體表面積系數(shù)比確定。給藥劑量以臨床人用藥等效劑量作為中劑量，低、中、高劑量溫肺降濁方組給藥劑量分別為3.75、7.50、15.0 g·kg-1·d-1，石杉堿甲組給藥劑量為0.15 mg·kg-1·d-1。灌胃濃度每天按1 ml/100 g大鼠體重進行。其中假手術(shù)組及模型組均予相應(yīng)體積的雙蒸水灌胃。所有大鼠灌胃給藥均為1次/d，共30 d。30 d后行Morris水迷宮實驗檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化情況。

1.7HE染色 Morris水迷宮實驗完畢后，每組隨機取7只大鼠進行心臟灌注取腦，先后用0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛進行灌注后，取全腦組織，分別裝入有4%多聚甲醛的標(biāo)本瓶中固定，保存在4℃冰箱中，固定不少于24 h。①經(jīng)固定后的腦組織，切去嗅球及小腦，常規(guī)石蠟包埋，冠狀面連續(xù)切片，厚度約4 μm；②切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗；③蘇木素染色；④1%鹽酸酒精分化，1%氨水反藍；⑤自來水浸泡；⑥置伊紅液；⑦常規(guī)脫水，透明，封片；⑧在光學(xué)顯微鏡下，觀察每組大鼠海馬切片CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1.8Western印跡實驗 用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠后，迅速將大鼠斷頭，在冰臺上快速分離出雙側(cè)海馬組織，立即置于2 ml EP管中，放入-80℃冰箱保存。①用蛋白裂解液提取蛋白，12 000 r/min離心10 min后取上清分裝放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用考馬斯亮藍試劑盒經(jīng)紫外可見分光光度計測定蛋白濃度；②制備SDS-PAGE凝膠；③樣品的變性及電泳，95℃變性10 min，電泳儀設(shè)置成穩(wěn)壓狀態(tài)，將電壓調(diào)至50 V使樣品通過濃縮膠與分離膠。目的條帶跑到分離膠2/3左右位置，停止電泳；④凝膠轉(zhuǎn)膜及洗膜，恒流250 mA轉(zhuǎn)膜，在含有5%的脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h。將封閉后的膜直接放入稀釋后的一抗工作液(Caspase-3及抗β-actin的抗體)中，4℃反應(yīng)過夜。用1×PBST洗膜3次。將二抗(山羊抗兔)用1×PBST稀釋3 000倍；將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中作用90 min。再用1×PBST洗膜3次；⑤曝光及洗片，按1∶1(v/v)混合ECL試劑盒中AB液，放入暗盒中，根據(jù)條帶的亮度選擇適當(dāng)?shù)钠毓鈺r間，經(jīng)顯影定影液顯色，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的灰度值。用所測蛋白Caspase-3的灰度值分別與內(nèi)參照β-actin的灰度值比較，所得的比值表示所測蛋白的相對表達量。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1定位航行實驗結(jié)果 在定位航行的第5天，模型組平均逃避潛伏期比假手術(shù)組明顯延長(P<0.01)。石杉堿甲組和低、中、高劑量溫肺降濁方組的平均逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.01)。低、中、高劑量溫肺降濁方組間平均逃避潛伏期有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。低、中、高劑量溫肺降濁方組與石杉堿甲組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。見表1。

2.2空間搜索實驗結(jié)果 模型組較假手術(shù)組大鼠成功找到平臺的次數(shù)明顯減少(P<0.01)。而石杉堿甲組和低、中、高劑量溫肺降濁方組的平均跨越平臺次數(shù)均較模型組明顯增多(P<0.01)。高、中劑量溫肺降濁方組與低劑量溫肺降濁方組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。各藥物組以高劑量溫肺降濁方組找到平臺的次數(shù)為多。見表1。

表1 各組大鼠第5天逃避潛伏期、跨越平臺次數(shù)比較(±s)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.01;與石杉堿甲組比較：3)P<0.01;與高劑量溫肺降濁方組比較：4)P<0.01

2.3HE染色結(jié)果 經(jīng)HE染色后，細胞質(zhì)呈淡紅色，核呈藍褐色。假手術(shù)組海馬CA1區(qū)細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，細胞形態(tài)完整、正常。模型組海馬CA1區(qū)細胞排列不整，細胞體積縮小，細胞核固縮、深染。低劑量溫肺降濁方組海馬CA1區(qū)細胞排列尚可，見部分細胞核固縮、深染。中劑量溫肺降濁方組海馬CA1區(qū)排列較整齊，細胞核固縮、深染現(xiàn)象較模型組、低劑量溫肺降濁方組少。高劑量溫肺降濁方組與石杉堿甲組海馬CA1區(qū)細胞排列整齊，密度增加，細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元形態(tài)異常較模型組明顯減輕，以高劑量溫肺降濁方組作用最為顯著。見圖1。

2.4Western印跡實驗結(jié)果 模型組(0.80±0.03)較假手術(shù)組Caspase-3蛋白表達明顯增加(0.14±0.02，P<0.01)。石杉堿甲組(0.36±0.02)、低、中、高劑量溫肺降濁方組(0.58±0.01、0.46±0.01、0.22±0.03)與模型組比較Caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.01)。低、中、高劑量溫肺降濁方組三者組間Caspase-3蛋白表達比較有差異(P<0.01)；高劑量溫肺降濁方組與假手術(shù)組、石杉堿甲組比較有差異(P<0.01)；各藥物組中，以高劑量溫肺降濁方組抑制Caspase-3蛋白表達的作用最為顯著。見圖2。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)病理改變(HE，×200)

1：假手術(shù)組；2：模型組；3：低劑量溫肺降濁方組；4：中劑量溫肺降濁方組；5：高劑量溫肺降濁方組；6：石杉堿甲組圖2 各組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白的變化

3 討 論

VD發(fā)生與肺臟虛損及功能失調(diào)關(guān)系密切，若肺、腎陽不足、肺氣虛損，無以溫養(yǎng)腦竅，升機不利則無以充養(yǎng)腦髓，則會導(dǎo)致濁毒、痰濕、瘀血等病理產(chǎn)物堆積致病，最終產(chǎn)生呆、傻、愚、笨的癡呆表現(xiàn)。

腦血管病是引發(fā)VD的主要原因，VD形成的重要因素之一即為由頸部血管逐漸狹窄引起的長期慢性腦供血不足。研究表明，當(dāng)行2-VO法后，前腦組織不會造成血供的完全阻斷，而是處于缺血的狀態(tài)〔4〕。該法實質(zhì)上較好地模擬了人類因動脈粥樣硬化及動脈管腔狹窄等因素導(dǎo)致慢性腦血管疾病因素

引起的VD。趙憲林等〔3〕認為該模型既可以判定藥物的效果和治療的手段，還可用于研究癡呆腦組織的形態(tài)、病理以及生理變化的機制。本實驗結(jié)果證明本實驗?zāi)Ｐ褪浅晒Φ?，而在?jīng)溫肺降濁方能夠不同程度地改善VD模型大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)異常。

Morris水迷宮實驗?zāi)茌^真實地反映動物學(xué)習(xí)與記憶的能力〔5〕。Morris水迷宮近年來在神經(jīng)生物學(xué)、神經(jīng)藥理學(xué)、神經(jīng)病學(xué)等領(lǐng)域上有著十分廣泛的應(yīng)用，它是國際上測定動物空間學(xué)習(xí)及記憶能力方法的常用技術(shù)。本實驗Morris水迷宮結(jié)果顯示，模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯受到損害，而溫肺降濁方對VD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用，且存在一定的量效關(guān)系。

研究表明，活化后的Caspase-3還可直接誘導(dǎo)線粒體自由基的產(chǎn)生，加速線粒體的功能障礙和細胞色素C釋放，使凋亡信號不斷放大，涉及范圍不斷的擴增，最終引起細胞凋亡〔6〕。Caspase-3處于凋亡惡性級聯(lián)反應(yīng)的下游，是細胞凋亡的必經(jīng)之路，它的激活是細胞凋亡進入不可逆轉(zhuǎn)階段的重要標(biāo)志。我國科學(xué)家利用先進的分子生物學(xué)技術(shù)證實了Caspase-3基因和凋亡的關(guān)系，Caspase-3基因被敲除后，細胞則完全喪失凋亡的能力，然而敲除其他的Caspase基因，細胞的凋亡功能并沒有完全喪失〔7〕。由此可知，Caspase-3蛋白表達與否和細胞凋亡的發(fā)生關(guān)系密切。因此，尋找切斷凋亡發(fā)生的路徑，調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡因子的表達，阻止凋亡的發(fā)生，改善VD的學(xué)習(xí)、記憶能力，是治療VD的關(guān)鍵所在。本實驗結(jié)果表明溫肺降濁方可減少Caspase-3蛋白的表達，抑制神經(jīng)元凋亡。

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3趙憲林，方秀斌，李東培.大鼠血管性癡呆模型制作〔J〕.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002；31(3)：166-7.

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5李 林，夏保蘆，茹立強，等.血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的實驗研究〔J〕.江漢大學(xué)學(xué)報，2008；36(4)：54-6.

6Sun M，Zhao YM，Gu Y，etal.Inhibition of nNOS reduces ischemic cell death through down-regulating calpain and caspase-3 after experimental stroke〔J〕.Neurochem Int，2009；7(5-6)：339-46.

7Zheng TS，F(xiàn)lavell RA.Divinations and surprises：genetic analysis of caspases function in mice〔J〕.Exp Cell Res，2000；256：67-73.

〔2016-05-07修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點實驗室系統(tǒng)課題(No.KJT13077)

唐 農(nóng)(1962-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病研究。

吳 林(1970-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病研究。

R743

A

1005-9202(2017)16-3922-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.006

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院