黃華佗+王榮+陸玉蘭+覃海媚+向陽(yáng)+郭靜+王春芳+韋葉生

【摘要】目的研究白細(xì)胞介素17A（IL-17A）基因rs3748067位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）在廣西人群中的分布特點(diǎn)，比較其基因型和等位基因頻率在不同種族、地區(qū)人群間的分布差異。方法用SNaPshot SNP分型技術(shù)和DNA測(cè)序法檢測(cè)443例廣西人群rs3748067 位點(diǎn)SNPs，分析其基因型和等位基因頻率與國(guó)際人類(lèi)基因組單體型圖（Haplotype map，HapMap）計(jì)劃公布的北京漢族人群（HapMap-CHB）、日本人群（HapMap-JPT）、非洲人群（HapMap-YRI）和印度人群（HapMap-GIH）間的差異。 結(jié)果廣西人群rs3748067位點(diǎn)存在GG、GA和AA三種基因型，其頻率分別為82.2%、17.4%和0.4%，G和A等位基因頻率分別為90.9%和9.1%。廣西人群IL-17A基因rs3748067位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在同一種族不同性別間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。廣西人群IL-17A基因rs3748067位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與HapMap-CHB人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），然而與HapMap-JPT、HapMap-YRI和HapMap-GIH人群比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論廣西人群存在IL-17A基因rs3748067位點(diǎn)多態(tài)性，與其他種族、地區(qū)人群比較存在不同程度的差異，這些差異可能是導(dǎo)致IL-17A基因相關(guān)疾病在不同種族、地區(qū)人群間臨床表現(xiàn)和發(fā)病率存在較大差異的因素之一。

【關(guān)鍵詞】IL-17A；基因多態(tài)；種族

中圖分類(lèi)號(hào)：R394文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.04.001

【Abstract】ObjectiveTo explore the distribution characteristics of SNPs（single nucleotide polymorphisms）of IL-17A（Interleukin-17A）in gene rs3748067 locus in Guangxi population，and to compare its genotype and allele frequency among populations with different races and regions.MethodsThe SNPs in rs3748067 locus among 443 people in Guangxi was detected by SNaPshot SNP and DNA sequencing methods.Then their genotype and allele frequency were compared with HapMap-CHB，HapMap-JPT，HapMap-YRI and HapMap-GIH published by international HapMap（Haplotype map）project.ResultsGG，GA and AA genotypes existed in rs3748067 locus，and the frequency of them was 82.2%，17.4% and 0.4% respectively，and the frequency of G and A allele was 90.9% and 9.1% respectively.The genotype and allele frequencies of IL-17A gene at rs3748067 locus in Guangxi population were not statistically different between the same races（P>0.05）.Difference of the genotype and allele frequencies of IL-17A gene at rs3748067 locus between Guangxi population and HapMap-CHB population was not statistically significant（P>0.05），however，that of the genotype and allele frequencies of IL-17A gene at rs3748067 locus between Guangxi population and HapMap-JPT，HapMap-YRI and HapMap-GIH populations was statistically significant（P<0.01）.ConclusionThere is a polymorphism of IL-17A at gene rs3748067 in Guangxi population，with different levels of difference while comparing with other races and regions.And the difference may be one of the factors that causes difference of clinical manifestations and morbidity of IL-17A gene related diseases in populations among different races and region.

【Key words】IL-17A；genetic polymorphism；race

白細(xì)胞介素-17A（Interleukin-17A，IL-17A）為IL-17家族成員之一，同時(shí)也是最早被發(fā)現(xiàn)的成員[1]。輔助T細(xì)胞Th17為IL-17A的主要分泌細(xì)胞，此外IL-17A還廣泛表達(dá)于中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、γδ-T細(xì)胞和NK細(xì)胞等多種免疫、炎癥相關(guān)細(xì)胞中[2～3]。IL-17A通過(guò)與其異二聚體受體IL-17RA-IL-17RC結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，被活化后的IL-17RA-IL-17RC二聚體通過(guò)核因子KB 激活劑1（ACT1）激活NF-kB信號(hào)通路，引起促炎癥因子（IL-1、IL-6、TNF 和 IL-8）、細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）以及CXCL1、CXCL2 和 CXCL8等趨化因子的釋放[4～5]，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病以及多發(fā)性硬化等多種自身免疫和炎癥相關(guān)疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3]。IL-17A調(diào)節(jié)異常與多種免疫和炎癥疾病發(fā)病相關(guān)，然而，其具體機(jī)制目前尚未被完全闡明。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，IL-17A基因SNPs與兒童鏈球菌肺炎、肺結(jié)核、牙周炎、哮喘和動(dòng)脈粥樣硬化等免疫炎癥相關(guān)疾病以及胃癌等發(fā)病相關(guān)[6～10]。目前，廣西人群IL-17A基因rs3748067多態(tài)性的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，我們利用SNaPshot SNP分型技術(shù)和DNA測(cè)序法檢測(cè)rs3748067多態(tài)性，并將所得結(jié)果與國(guó)際人類(lèi)基因組單體型圖（Haplotype map，HapMap）計(jì)劃公布的不同種族和地區(qū)人群的結(jié)果比較，分析不同種族和地區(qū)人群間rs3748067多態(tài)性的分布差異，旨在為后期IL-17A基因相關(guān)疾病的研究和群體遺傳學(xué)研究提供參考。endprint

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象研究對(duì)象共443 例，其中男性278 例，女性165 例，年齡25～84歲，均為右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心健康體檢者，通過(guò)各項(xiàng)血液和影像學(xué)檢查，未發(fā)現(xiàn)腫瘤以及肝臟、腎臟、心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，排除遺傳病家族史。所有研究對(duì)象均為相互間無(wú)血緣關(guān)系的廣西地區(qū)人群。

1.2研究方法

1.2.1基因組DNA提取用EDTA-K2抗凝的采血管采集體檢者靜脈血3 ml，放于-50℃冰箱保存?zhèn)溆?。基因組DNA提取采用試劑盒離心柱法（TIANamp Blood DNA Kit），提取后存放在-50℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成 在NCBI上查找并選取包含rs3748067位點(diǎn)的適宜長(zhǎng)度DNA片段，輸入網(wǎng)頁(yè)P(yáng)rimer 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，得出序列交予上海天昊生物科技有限公司合成。rs3748067上游引物序列為：CACTCCTAGGGCCTGGCTTCTG，下游引物序列為：GGATGGAGCAGGATGGAGTGAA，延伸引物序列為：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGCTGAACTTTTCTCATACTTAAA。

1.2.3PCR擴(kuò)增及測(cè)序 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20 μL）包含1x GC-I buffer（Takara.），3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase （Qiagen Inc.），1 μL 樣本DNA和1 μL多重PCR引物，不足的體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)充。PCR產(chǎn)物用5 U SAP酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶純化后用SNaPshot Multiplex Kit （ABI）進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸產(chǎn)物加入1 U SAP酶純化后上ABI3730XL測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1（Applied Biosystems Co.，Ltd.，USA）分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算在SPSS 17.0軟件上完成。基因型和等位基因的頻率用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算。基因型和等位基因數(shù)據(jù)屬于計(jì)數(shù)資料，不同組間基因型和等位基因頻率的比較分別用行×列表χ2檢驗(yàn)和四格表χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2結(jié)果

2.1IL-17A基因rs3748067位點(diǎn)分型 IL-17A基因rs3748067位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為287 bp。測(cè)序結(jié)果表明，rs3748067位點(diǎn)包含GG、GA和AA三種基因型，其頻率分別為82.2%、17.4%和0.4%，G和A等位基因頻率分別為90.9%和9.1%。基因測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)我們的結(jié)果。見(jiàn)圖1。

圖A、B、C箭頭指向分別表示GG、GA和AA基因型。

2.2IL-17A基因rs3748067位點(diǎn)多態(tài)性在不同性別間的比較 經(jīng)檢驗(yàn)，廣西人群IL-17A基因rs3748067位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)符合哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）法則（P= 0.33），表明本次實(shí)驗(yàn)所選研究對(duì)象具有群體代表性。IL-17A基因rs3748067位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在廣西人群不同性別間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.3IL-17A基因rs3748067位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與其他不同種族和地區(qū)人群的比較廣西人群IL-17A基因rs3748067位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與HapMap-JPT、HapMap-YRI和HapMap-GIH人群比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），然而與HapMap-CHB人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2和表3。

3討論

編碼IL-17A的基因位于6號(hào)染色體短臂上（6p12.2），包含3個(gè)外顯子。國(guó)際人類(lèi)基因組單體型圖計(jì)劃掃描發(fā)現(xiàn)，IL-17A基因存在多個(gè)功能性SNPs位點(diǎn)，這些位點(diǎn)多態(tài)性改變可能會(huì)引起IL-17A編碼活性及IL-17A基因相關(guān)疾病遺傳易感性發(fā)生改變，導(dǎo)致IL-17A相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。最近研究表明，IL-17A基因rs3748067 SNP與胃癌、肺結(jié)核、冠心病、塵肺、布魯氏菌感染以及潰瘍性結(jié)腸炎等疾病的遺傳易感性相關(guān)，引起人們廣泛關(guān)注[10～15]。然而，基因多態(tài)性可因地理位置、環(huán)境、飲食和生活習(xí)慣以及種族不同呈現(xiàn)不同程度差異，而同一SNP位點(diǎn)在不同種族、地區(qū)人群間對(duì)疾病遺傳易感性的影響也表現(xiàn)出很大區(qū)別。例如，Vazgiourakis等[16]在希臘進(jìn)行的病例對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，CD40基因rs4810485位點(diǎn)基因型和等位基因在SLE組和對(duì)照組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，T等位基因降低了希臘人SLE的患病風(fēng)險(xiǎn)（OR=0.65，95% CI 0.54～0.79）。然而Piotrowski等[17]人卻在波蘭進(jìn)行的病例對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，rs4810485基因型和等位基因頻率在SLE組和對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見(jiàn)，不同種族和地區(qū)人群間正常人群基因多態(tài)性研究可為我們提供這些地區(qū)人群的遺傳背景資料，為與之相關(guān)疾病的遺傳多態(tài)性研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

本研究發(fā)現(xiàn)，IL-17A基因rs3748067位點(diǎn)SNP在廣西人群不同性別間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明rs3748067位點(diǎn)SNP在同一人群無(wú)性別間差異。進(jìn)一步將廣西人群數(shù)據(jù)與國(guó)際人類(lèi)基因組單體型圖計(jì)劃公布的HapMap-CHB、HapMap-JPT、HapMap-YRI、HapMap-GIH人群比較發(fā)現(xiàn)，廣西人群rs3748067基因型和等位基因頻率與HapMap-JPT、HapMap-YRI、HapMap-GIH人群比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），然而與HapMap-CHB人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。廣西人群rs3748067 G等位基因頻率，與同一種族的HapMap-CHB人群G等位基因頻率相近，然而與HapMap-JPT、HapMap-YRI以及HapMap-GIH人群的G等位基因頻率相差較大。HapMap-JPT、HapMap-YRI、HapMap-GIH和廣西人群屬于不同種族，地理位置和親緣關(guān)系遠(yuǎn)，且在飲食和生活習(xí)慣上存在較大差異，這可能是造成他們之間遺傳差異較大的原因。而HapMap-HCB人群與廣西人群雖在飲食和生活習(xí)慣以及氣候上有較大差別，但二者屬同一種族，且地理位置和親緣關(guān)系較近，因此二者遺傳差異較小。以上基因型和等位基因的分析結(jié)果均與“親緣關(guān)系越近，基因型的分布差異越小”的遺傳定律吻合。endprint

隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，基因多態(tài)性的研究更多地趨向于局部的、多民族和多地區(qū)的分散研究?；蚨鄳B(tài)研究的展開(kāi)在解釋不同群體、個(gè)體對(duì)疾病特別是對(duì)復(fù)雜疾病的易感性和對(duì)各種藥物的耐受性以及對(duì)環(huán)境因子反應(yīng)的表型差異方面起著很大的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，廣西人群存在IL-17A基因rs3748067遺傳多態(tài)性，其基因型和等位基因頻率與不同種族、地區(qū)人群比較存在不同程度的差異。廣西人群IL-17A基因rs3748067遺傳多態(tài)性的研究將為群體遺傳學(xué)和IL-17A基因相關(guān)疾病的研究提供參考資料，同時(shí)可為廣西地區(qū)建立區(qū)域基因數(shù)據(jù)庫(kù)貢獻(xiàn)一份力量。

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