何文平， 楊鵬軍， 張旭強(qiáng)， 王新霞， 仇奕之， 林美貞， 楊 寧

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 甘肅 蘭州730070)

植物生長(zhǎng)受多種調(diào)控因子的影響，而溫度是這些調(diào)控因子中一個(gè)重要因素，溫度的變化直接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育?；钚匝?Reactive oxygen ROS)是植物有氧代謝的產(chǎn)物，在植物很多生理過(guò)程中均發(fā)揮作用。植物在正常條件下能產(chǎn)生ROS[1]，此時(shí) ROS的產(chǎn)生與清除處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中。環(huán)境脅迫引發(fā)ROS的產(chǎn)生并過(guò)度積累[2]。早在1998年時(shí)，Rauen等[3]發(fā)現(xiàn)冷脅迫能引發(fā)肝癌細(xì)胞ROS的釋放[3]； 1994年P(guān)rasad[4]發(fā)現(xiàn)在玉米幼苗中低溫能夠引發(fā)ROS的大量產(chǎn)生。之后類似的研究越來(lái)越多。積累的ROS會(huì)損傷膜脂流動(dòng)性,擾亂細(xì)胞的正常代謝[5]，在這個(gè)過(guò)程中因膜磷脂過(guò)氧化引起的膜損傷是ROS對(duì)植物傷害的事件之一。另外細(xì)胞和細(xì)胞器膜脂質(zhì)過(guò)氧化后會(huì)直接影響細(xì)胞功能并加重氧化脅迫[6]，結(jié)果是膜磷脂被過(guò)氧化并且降低了膜的流動(dòng)性，在磷脂雙分子層中磷脂代謝的速率加快，同時(shí)也增加了膜對(duì)底物的滲透率[7]。

PLD在植物中普遍存在，其活性直接影響膜的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性[8]。PLD對(duì)于膜的影響相當(dāng)顯著，嚴(yán)重時(shí)能導(dǎo)致膜的功能和完整性喪失[9]。除此之外，PLD可根據(jù)刺激強(qiáng)度傳遞膜重建和降解的信號(hào)[10]，例如在干旱脅迫早期階段PLD轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)氣孔關(guān)閉的信號(hào)，而延長(zhǎng)干旱脅迫后，PLD卻加速膜降解[11]。

有關(guān)ROS和PLD之間的相互作用的研究已有很多，例如在擬南芥中PLD參與ROS的產(chǎn)生并且增加NADPH氧化酶的活性[12]；在水稻細(xì)胞中，H2O2誘導(dǎo)PLD活性是水稻細(xì)胞抗毒素生物合成的必須過(guò)程[13]；在擬南芥中，H2O2誘導(dǎo)PLD降低了ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等[14]。這些研究說(shuō)明ROS與PLD之間存在著一定的作用關(guān)系，然而是通過(guò)怎樣的機(jī)制來(lái)維持兩者的相互作用目前還無(wú)明確報(bào)道。

基于此，我們以高山離子芥(chorisporabungeana)作為試驗(yàn)材料，以低溫(4℃，0℃和-4℃)作為脅迫因子，研究低溫引發(fā)的內(nèi)源性ROS對(duì)線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的調(diào)控作用，以期進(jìn)一步揭示ROS對(duì)PLD活性的調(diào)控機(jī)制。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試管苗的培養(yǎng)

高山離子芥試管苗的培養(yǎng)根據(jù)楊寧等的方法[15]。種子去皮并用70%乙醇浸泡，再用0.1%升汞浸泡5～8 min，無(wú)菌水沖洗3次，種子直接接種于MS培養(yǎng)基中(不含任何激素)并置于光照培養(yǎng)架上(25℃，2 000 lx，12 h光照)培養(yǎng)。待種子萌發(fā)長(zhǎng)至一定高度后將試管苗接種于MS培養(yǎng)基(MS+0.2 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+7.8 g·L-1瓊脂，pH 5.8，溫度25℃，光照周期為12 h)中培養(yǎng)15 d，然后用于試驗(yàn)。

1.2 材料的處理

H2O2處理：將1，5和10 mmol·L-1H2O2分別添加于MS培養(yǎng)基中，然后將生長(zhǎng)旺盛的高山離子芥接種于該培養(yǎng)基中并外施上述濃度的H2O2于葉上；EGTA處理：將5 mmol·L-1EGTA添加于MS培養(yǎng)基中；CaCl2處理：將 10 mmol·L-1CaCl2添加于MS培養(yǎng)基中；DPI處理：將12.5 μmol·L-1的DPI添加于MS培養(yǎng)基中；DPI+ CaCl2處理：將12.5 μmol·L-1DPI和10 mmol·L-1CaCl2添加于MS培養(yǎng)基中，然后將生長(zhǎng)旺盛的高山離子芥接種于上述培養(yǎng)基中，以上處理的材料(不同濃度H2O2處理組正常培養(yǎng))均置于人工培養(yǎng)箱中，分別在4℃，0℃和-4℃中低溫培養(yǎng)6～72 h。試驗(yàn)設(shè)置0 h作為對(duì)照組。

2 試驗(yàn)方法

2.1 高山離子芥磷脂酶D的制備

磷脂酶D的制備根據(jù)Mao等的方法并略作改變[16]。取0.5 g高山離子芥置于預(yù)冷的研缽中研磨，以研缽10 mmol·L-1pH 7.0 的HEPES 為提取緩沖液，研制成10%的勻漿然后將勻漿轉(zhuǎn)入到離心管中于高速臺(tái)式離心機(jī)(Beckman，型號(hào):Allegram64R)以1 000 g(Rotor：F1010)離心15 min去掉碎片。上清液以15 000 g(Rotor：F1010)的離心力離心60 min得到線粒體膜蛋白，所得到的這些蛋白融于100 mmol·L-1pH 6.5的DMG中，此時(shí)的溶液為線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD酶液。

2.2 磷脂酶D活性的測(cè)定

磷脂酶D活性的測(cè)定用酶聯(lián)免疫法[17]，在離心管中配制200 μL的反應(yīng)體系，其中100 mmol·L-1DMG(pH 6.5)，10 mmol·L-1MgCl2， 0.1 mmol·L-1CaCl2， 5 mmol·L-1亞油酸，20 μL酶液以及12 mmol·L-1PC(最后加入)。反應(yīng)體系于30℃水浴中反應(yīng)30 min，然后在沸水浴終中中止反應(yīng)15 min。冷卻后加入顯色液800 μL，在30℃水浴中反應(yīng)60 min，待顏色穩(wěn)定后加入脫蛋白液，搖勻，用0.22 μm孔徑的濾膜濾去雜蛋白，最后于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Agilent，型號(hào)：G1115A)中500 nm處測(cè)OD值。

2.3 線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量的測(cè)定

線粒體膜的提取方法同2.1。膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量的測(cè)定根據(jù)趙宇瑛的方法并略作修改[18]，得到的線粒體膜沉淀用懸浮液(0.125 mol·L-1蔗糖，1 mmol·L-1Tris-Mes(pH7.2)，6 mmol·L-1β-巰基乙醇)懸浮，隨后加入HCl使其終濃度為0.2 mol·L-1。將混合液震蕩搖勻后，在15 000 g的作用下離心30 min，所得的上清液用原子吸收分光光度儀檢測(cè)Ca2+含量。

2.4 H2O2含量的測(cè)定

H2O2含量的測(cè)定采用Prochazkova D的方法略作修改[19]，稱取0.2 g高山離子芥葉，添加2 mL0.1%預(yù)冷的三氯乙酸研磨成原漿，在12 000 g離心力下離心20 min，然后將上清液1 mL與等體積的磷酸緩沖液(10 mmol·L-1，pH 7.0)及1 mol·L-1KI混勻，于390 nm測(cè)吸光值，結(jié)果以μmol·L-1(FW)表示。

2.5 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0對(duì)組內(nèi)隨時(shí)間變化的差異性進(jìn)行多重比較,采用LSD法分析，利用origin pro9.0軟件作圖。

3 結(jié)果分析

3.1 H2O2對(duì)高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的的影響

為了說(shuō)明H2O2對(duì)線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性產(chǎn)生的影響，在正常培養(yǎng)條件下用不同濃度H2O2處理高山離子芥，結(jié)果如圖1所示。3個(gè)濃度H2O2處理后，PLD活性均表現(xiàn)出較對(duì)照組升高，但各濃度H2O2處理下PLD活性在0～72 h過(guò)程中變化規(guī)律不一致。H2O2對(duì)PLD活性的影響在0～72 h的過(guò)程中表現(xiàn)出低濃度H2O2對(duì)PLD活性的誘導(dǎo)作用高于高濃度；并且在72 h時(shí)，3個(gè)濃度處理下PLD活性均達(dá)到最大值，分別高出對(duì)照組290.0%，163.4%和102.7%。

3.2 低溫脅迫對(duì)高山離子芥葉中H2O2含量的影響

在4℃，0℃和-4℃條件下處理高山離子芥72 h后，其葉中H2O2含量如圖2所示。在3個(gè)溫度脅迫下H2O2含量在0～6 h過(guò)程中增加隨后在0℃和-4℃處理組中H2O2含量降低直到72 h。而在4℃的處理組中H2O2含量持續(xù)增加直到72 h且在該溫度下72 h時(shí)H2O2含量達(dá)到最大值，此時(shí)H2O2含量較空白對(duì)照組上升了134.4%。在0℃和-4℃條件下處理6 h時(shí)兩者H2O2含量達(dá)到最大值，且分別較空白對(duì)照組上升了112.4%和184.2%。在整個(gè)脅迫過(guò)程中，3個(gè)溫度處理下H2O2含量均高于對(duì)照組。

圖1 H2O2對(duì)高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響
Fig.1 The effect of H2O2on the activity of mitochondrial membrane bound-PLD in chorispora bungeana leaves
注:圖中不同的小寫(xiě)字母表示同一濃度處理不同時(shí)間上差異顯著(P<0.05)；不同的大寫(xiě)字母表示同一處理時(shí)間不同濃度上差異顯著(P<0.05)，下同
Note: Different lowercase letters indicate significant difference at different treatment time of the same concentration， different uppercase letters indicate significant difference under different concentration at the same treatment time at the 0.05 level. The same below

圖2 低溫脅迫下高山離子芥葉中H2O2含量的變化
Fig.2 The change of H2O2content in leaves of chorispora bungeana under low temperature

3.3 低溫脅迫對(duì)高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響

在4℃，0℃和-4℃條件下處理高山離子芥72 h后葉,中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性變化如圖3所示。在3個(gè)溫度作用下PLD活性均表現(xiàn)出較空白對(duì)照組升高，在4℃脅迫下PLD活性持續(xù)增加；在0℃和-4℃脅迫下PLD活性在0～6 h過(guò)程中增加隨后降低。在4℃脅迫下72 h時(shí)PLD活性達(dá)到最大值，此時(shí)相對(duì)于空白對(duì)照組上升190.6%。在0℃和-4℃處理組中6 h時(shí)PLD活性達(dá)到最大值，此時(shí)相對(duì)于空白對(duì)照組分別上升了182.5%和145.4%。

圖3 低溫脅迫下高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的變化
Fig.3 The change of mitochondrial membrane bound phospholipase D in leaves of chorispora bungeana under low temperature

3.4 低溫脅迫下DPI處理對(duì)高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響

DPI是NADPH氧化酶的抑制劑。在4℃，0℃和-4℃脅迫下，添加12.5 μmol·L-1DPI處理高山離子芥后線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性變化如圖4所示。在4℃脅迫下，對(duì)照組中PLD活性持續(xù)增加，到72 h時(shí)PLD活性達(dá)到最大值，此時(shí)較空白對(duì)照組PLD活性上升了190.6%。添加DPI處理后在6～72 h過(guò)程中，PLD活性均較對(duì)照組降低。在24 h時(shí)添加DPI處理的PLD活性與其他時(shí)間點(diǎn)相比較對(duì)照組PLD活性下降最低，此時(shí)較對(duì)照組PLD下降17.4%。在0℃和-4℃脅迫下對(duì)照組中PLD活性在0～6 h過(guò)程中升高，在6 h時(shí)兩者PLD活性均達(dá)到最大值，與空白對(duì)照組相比分別升高了196.5%和145.4%。添加DPI處理后在6～72 h過(guò)程中，PLD活性較對(duì)照組中PLD活性低。在0℃和-4℃脅迫下72 h時(shí)添加DPI處理的PLD活性與其他時(shí)間點(diǎn)相比較對(duì)照組PLD活性下降最低，此時(shí)相對(duì)于對(duì)照組PLD活性分別下降15.1%和21.0%。

圖4 低溫脅迫下DPI對(duì)高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響
Fig.4 The effect of DPI on the activity of mitochondrial membrane bound PLD in leaves of chorispora bungeana under low temperature

3.5 低溫脅迫下DPI處理對(duì)高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量的影響

在4℃，0℃和-4℃脅迫下，添加12.5 μmol·L-1DPI處理高山離子芥后線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量變化如圖5所示。在4℃脅迫下對(duì)照組中線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量持續(xù)降低，到72 h時(shí)Ca2+含量達(dá)到最低值，此時(shí)與空白對(duì)照組相比Ca2+含量下降了77%。添加DPI處理后在6～72 h過(guò)程中，線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量較對(duì)照組中Ca2+含量升高。在6 h時(shí)DPI處理組中Ca2+含量與其他時(shí)間點(diǎn)相比較對(duì)照組中Ca2+含量升高最低，此時(shí)相對(duì)于對(duì)照組中Ca2+含量升高23.07%。在0℃和-4℃條件下對(duì)照組中Ca2+含量在0～6 h過(guò)程中降低隨后升高，在6 h時(shí)兩者Ca2+含量均達(dá)到最低值，與空白對(duì)照組相比分別降低了49.9%和33.1%。添加DPI處理后在6～72 h過(guò)程中，Ca2+含量較對(duì)照組中Ca2+含量升高。在0℃和-4℃脅迫下72 h時(shí)DPI處理組中Ca2+含量與其他時(shí)間點(diǎn)相比較對(duì)照組中Ca2+含量升高最低，此時(shí)相對(duì)于對(duì)照組中Ca2+含量升高18.4%和8.7%。

圖5 低溫脅迫下DPI對(duì)高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量的影響
Fig.5 The effect of DPI on the activity of mitochondrial membrane boundCa2+content in leaves of chorispora bungeana under low temperature

3.6 低溫脅迫下DPI+CaCl2處理對(duì)高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響

在4℃，0℃和-4℃脅迫下添加12.5 μmol·L-1DPI+10 mmol·L-1CaCl2處理高山離子芥后， 線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性變化如圖6所示。在4℃條件下DPI處理組中，PLD活性在6～72 h過(guò)程中持續(xù)增加，到72 h時(shí)PLD活性達(dá)到最大值，此時(shí)與0 h 處理組相比活性上升了125.2%；添加CaCl2處理后在6～72 h過(guò)程中PLD活性均較DPI處理組增加且在6 h時(shí)PLD活性相對(duì)于DPI處理組中PLD活性上升最低，此時(shí)與DPI處理組中PLD活性相比上升14.2%。在0℃和-4℃脅迫下0～6 h過(guò)程中DPI處理組PLD活性增加；在6 h時(shí)PLD活性達(dá)到最大值分別高出空白對(duì)照組98.9%和36.9%。添加CaCl2處理后兩者在6～72 h過(guò)程中PLD活性均增加且均高于DPI處理組中PLD活性。

圖6 低溫脅迫下DPI+CaCl2對(duì)高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響
Fig.6 The effect of DPI+CaCl2on the activity of mitochondrial membrane bound-PLD in leaves of chorispora bungeana under low temperature

3.7 低溫脅迫下EGTA處理對(duì)高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響

在4℃，0℃和-4℃脅迫下用5 mmol·L-1EGTA處理高山離子芥后線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性變化如圖7所示。在4℃脅迫下對(duì)照組中 PLD活性持續(xù)增加且在72 h時(shí)活性達(dá)到最大值，此時(shí)相對(duì)于空白對(duì)照組PLD活性上升了335.7%。添加EGTA處理后PLD活性較對(duì)照組PLD活性在6～72 h過(guò)程中降低且在48 h時(shí)EGTA處理組中PLD活性與其他時(shí)間點(diǎn)相比下降最小，此時(shí)相對(duì)于對(duì)照組PLD活性下降了28.4%。在0℃脅迫下對(duì)照組PLD活性在0～6 h過(guò)程中增加隨后降低，在6 h時(shí)活性達(dá)到了最大值，與空白對(duì)照組相比PLD活性上升了72.5%。加入EGTA處理后在6～72 h過(guò)程中，PLD活性均低于對(duì)照組且在72 h時(shí)EGTA處理組中PLD活性與其他時(shí)間點(diǎn)相比下降最小，此時(shí)相對(duì)于對(duì)照組PLD下降了18.2%。在-4℃脅迫下對(duì)照組中PLD活性在0～24 h過(guò)程中持續(xù)增加隨后降低，在24 h時(shí)PLD活性達(dá)到最大值，此時(shí)與對(duì)照組相比上升了156.5%。加入EGTA處理后在6～72 h過(guò)程中PLD活性均低于對(duì)照組，且在6 h時(shí)EGTA處理組中PLD活性與其他時(shí)間點(diǎn)相比下降最小，此時(shí)相對(duì)于對(duì)照組PLD下降了19.8%。

圖7 低溫脅迫下EGTA對(duì)高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響
Fig.7 The effect of EGTA on the mitochondrial membrane bound-PLD in leaves of chorispora bungeana under low temperature

4 討論與結(jié)論

有研究發(fā)現(xiàn)ROS對(duì)Ca2+有調(diào)控作用，例如動(dòng)物中ROS能增加神經(jīng)細(xì)胞胞漿中Ca2+含量[25]，氧化脅迫能誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+含量上升[26]并且對(duì)質(zhì)膜Ca2+通道也發(fā)揮著重要作用[27]。H2O2能激活多種Ca2+通道并促使胞內(nèi)Ca2+水平升高[28]；有學(xué)者認(rèn)為ROS是Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游調(diào)節(jié)因子[29]。在本研究中，當(dāng)用DPI處理高山離子芥后，其線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量高于對(duì)照組(圖5)，表明ROS促進(jìn)了線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+的釋放。PLD活性受Ca2+調(diào)控，但是調(diào)控PLD活性的Ca2+往往只需要微量級(jí)[30]。當(dāng)添加DPI后，PLD活性低于對(duì)照組(圖4)，而該條件下線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量卻高于對(duì)照組(圖5)，說(shuō)明ROS對(duì)線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的調(diào)控是通過(guò)鈣離子介導(dǎo)。趙宇瑛在研究機(jī)械損傷對(duì)黃瓜的作用時(shí)得到類似的結(jié)論[18]。本研究中DPI+CaCl2處理高山離子芥后，PLD活性高于DPI處理組(圖6)，并且當(dāng)用Ca2+螯合劑EGTA處理高山離子芥后，其PLD活性又降低(圖7)，這就進(jìn)一步說(shuō)明ROS對(duì)PLD活性的調(diào)控與Ca2+有關(guān)。但是由于胞質(zhì)Ca2+的來(lái)源復(fù)雜，難確定低溫脅迫下哪些途徑的Ca2+參與了ROS對(duì)線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的調(diào)控。因此在后續(xù)研究Ca2+參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件中弄清楚Ca2+的來(lái)源更有助于研究植物細(xì)胞中Ca2+參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

以上結(jié)果表明在高山離子芥葉中低溫脅迫引發(fā)的內(nèi)源性ROS通過(guò)Ca2+對(duì)線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性進(jìn)行調(diào)控。