蘇佳佳， 曾 杰， 邵鄰相

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

碳源饑餓對癌細胞和正常細胞增殖的影響*

蘇佳佳， 曾 杰， 邵鄰相

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

研究了共培養(yǎng)條件下碳源饑餓對癌細胞和正常細胞形態(tài)、生長和凋亡的影響.采用細胞體外共培養(yǎng)的方法，實驗分4組：對照組(25 mmol/L葡萄糖)及5，1和0 mmol/L葡萄糖組，分別處理共培養(yǎng)條件下的HeLa癌細胞和人臍帶正常細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)與生長，吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)雙重熒光染色檢測凋亡細胞的形態(tài)及數(shù)量．結果表明：對照組HeLa癌細胞和人臍帶正常細胞都分布均勻，貼壁性好，形態(tài)飽滿，多呈規(guī)則的梭形或多角形，折光性好，AO/EB雙染綠色熒光分布均勻；實驗組糖濃度越低，細胞存活時間越短，細胞收縮變圓并逐漸凋亡，AO/EB雙染細胞由綠色熒光逐漸變?yōu)槌赛S色熒光；相同糖濃度條件下人臍帶正常細胞比HeLa癌細胞存活時間更長．說明碳源饑餓使癌細胞先于正常細胞死亡．

碳源饑餓；HeLa癌細胞；人臍帶正常細胞；增殖；凋亡

細胞的生長需要充足的營養(yǎng)物質(zhì).Warburg[1]發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞比正常細胞的糖酵解代謝途徑活躍，甚至在氧氣充足的條件下，腫瘤細胞仍需大量攝取葡萄糖并優(yōu)先進行糖酵解，從而為癌細胞的快速生長和侵襲轉移提供能量.Hanahan等[2]認為，腫瘤細胞利用有氧糖酵解的特殊糖代謝方式，與正常細胞競爭能量時占據(jù)優(yōu)勢地位．與氧化磷酸化途徑相比，糖酵解途徑的產(chǎn)能效率低，腫瘤細胞需從細胞外環(huán)境攝取的葡萄糖的量大約是正常細胞的10多倍[3-4]．當體內(nèi)糖源耗盡后，正常細胞將轉向消耗脂肪和酮體，但腫瘤細胞不能利用脂肪酸或酮體．基于此特點，可以通過最大限度地限制葡萄糖供應而降低癌細胞的增殖[5-7]．

本實驗室前期工作已表明，碳源饑餓能夠顯著抑制HeLa癌細胞的增殖[8-9]．為了比較碳源饑餓對HeLa癌細胞和人臍帶正常細胞生長的影響，本實驗通過低糖處理共培養(yǎng)下的HeLa癌細胞和人臍帶正常細胞，比較了HeLa癌細胞和人臍帶正常細胞的生長增殖情況，為碳源饑餓用于癌癥治療提供科學依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

HeLa癌細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所(SICB)；臍帶取自浙江省金華市中心醫(yī)院.高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自蘭州百靈生物技術有限公司；無糖DMEM培養(yǎng)基、葡萄糖、青霉素、鏈霉素購自Sigma公司.細胞培養(yǎng)板購自NEST公司；其他常規(guī)試劑均購自金華市醫(yī)藥公司．TS-100型倒置顯微鏡、熒光顯微鏡購自日本尼康公司；3111型CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國熱電公司．

1.2 原代臍帶細胞分離與培養(yǎng)

將收集的細胞用完全培養(yǎng)基重懸，然后接種至培養(yǎng)瓶進行細胞培養(yǎng).用含冷磷酸鹽緩沖液的藍蓋瓶從醫(yī)院收取臍帶，冰盒 4 ℃下帶回實驗室，在無菌工作臺將臍帶在藍蓋瓶中清洗一遍，用鑷子夾出，放入已裝好磷酸鹽緩沖液的10 cm培養(yǎng)皿中清洗后轉入第2個培養(yǎng)皿中，清洗，擠出臍帶中的血液，切除臍帶一端2 cm或2 cm以上包括動脈夾痕跡處，轉入第3個皿中，用刀將臍帶交叉切成1～2 mm3左右的小塊，用彎頭鑷子將組織移入離心管內(nèi)，用磷酸鹽緩沖液重懸清洗組織塊，使組織塊沉降，去除上清液.如此重復2次以上．將1 mm3及更小的組織塊轉入1號細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，2 mm3及更小的組織塊轉入2號細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，比2 mm3大一點的組織塊轉入3號細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，其他組織塊轉入4號細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，4個瓶內(nèi)均加入足量濃度的2.5%胰蛋白酶，比例不低于20 mL∶1 g．將1～3號培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中，每5 min搖晃一次或用移液管進行吹打，使組織塊充分消化．1號瓶在30 min后收集細胞懸液，再加入胰蛋白酶消化，30 min后再次收集細胞懸液，直至組織塊完全消化．2號瓶在1 h后收集細胞懸液,再加入胰蛋白酶消化，1 h后再次收集細胞懸液，直至組織塊完全消化．3號瓶在1.5 h后收集細胞懸液,再加入胰蛋白酶消化，1.5 h后再次收集細胞懸液，直至組織塊完全消化．4號瓶放入4 ℃冰箱中過夜，然后放入培養(yǎng)箱中，每5 min搖晃一次，30 min后收集細胞懸液．將各培養(yǎng)瓶內(nèi)收集的細胞懸液反復吹打后加入完全培養(yǎng)基終止消化，然后1 200 r/min離心5 min后收集細胞．

1.3 HeLa癌細胞培養(yǎng)

HeLa癌細胞接種于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放置在37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長到80%～90%融合時用0.1%胰酶消化傳代．

1.4 臍帶細胞與HeLa癌細胞共培養(yǎng)

取臍帶細胞以密度為5×104/mL接種于含有圓形玻片的12孔板中，取HeLa癌細胞以密度為5×104/mL接種于含有方形玻片的12孔板中，待12 h細胞貼壁后，將方形玻片和圓形玻片轉移至6孔板的同一孔中，實驗分為4組：對照組、5 mmol/L 葡萄糖組、1 mmol/L葡萄糖組和0 mmol/L 葡萄糖組，在6孔板中加入含不同濃度糖的DMEM培養(yǎng)基，共培養(yǎng)HeLa癌細胞和人臍帶正常細胞24，48，72 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，拍照，然后吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)雙重熒光染色觀察細胞核染色質(zhì)的分布．

1.5 AO/EB雙重熒光染色

碳源饑餓分別處理24，48和72 h后取出細胞玻片，磷酸鹽緩沖液清洗3次.臨用前將吖啶橙(5 μg/mL)溶液和溴乙錠(5 μg/mL)溶液等體積混合.在玻片上滴加AO/EB混合液進行染色，熒光顯微鏡觀察，拍照.

2 結 果

2.1 碳源饑餓對共培養(yǎng)24 h人臍帶正常細胞與HeLa癌細胞形態(tài)及凋亡的影響

共培養(yǎng)條件下對照組細胞分布均勻，貼壁性好，形態(tài)飽滿，多呈規(guī)則的梭形或多角形，折光性好(見圖1中1和5)；AO/EB雙染細胞呈黃綠色熒光(見圖2中1和5)．5 mmol/L葡萄糖組細胞密度減小，形態(tài)正常，分布均勻，貼壁性良好(見圖1中2和6)；AO/EB雙染細胞呈黃綠色熒光(見圖2中2和6)．1 mmol/L葡萄糖組細胞密度減小,細胞形態(tài)正常,貼壁性良好(見圖1中3和7)；AO/EB雙染人臍帶正常細胞呈黃綠色熒光，HeLa癌細胞大多數(shù)呈黃綠色、少量呈橙紅色熒光(見圖2中3和7)．0 mmol/L葡萄糖組人臍帶正常細胞培養(yǎng)部分生長狀況良好、貼壁性良好、細胞密度降低，而HeLa癌細胞大部分收縮變圓，僅有極少量存活且細胞形態(tài)逐漸呈變圓趨勢(見圖1中4和8)；AO/EB雙染人臍帶正常細胞呈黃綠色熒光，HeLa癌細胞呈橙黃色熒光(見圖2中4和8)．

2.2 碳源饑餓對共培養(yǎng)48 h人臍帶正常細胞與HeLa癌細胞形態(tài)及凋亡的影響

共培養(yǎng)條件下對照組細胞密度增大，細胞分布均勻，貼壁性好，形態(tài)飽滿，多呈規(guī)則的梭形或多角形，折光性好(見圖1中9和13)；AO/EB雙染人臍帶正常細胞大部分呈黃綠色熒光,但有極少數(shù)呈橙黃色熒光，而HeLa癌細胞呈黃綠色熒光(見圖2中9和13)．5 mmol/L葡萄糖組細胞密度較培養(yǎng)24 h的增大，人臍帶正常細胞大部分貼壁性好、形態(tài)飽滿、折光性好，HeLa癌細胞部分開始收縮變圓逐漸凋亡(見圖1中10和14)；AO/EB雙染人臍帶正常細胞和HeLa癌細胞都有部分呈橙黃色熒光，部分人臍帶正常細胞呈黃綠色熒光、HeLa癌細胞呈亮綠色熒光(見圖2中10和14)．1 mmol/L葡萄糖組人臍帶正常細胞部分形態(tài)飽滿、貼壁性良好、呈規(guī)則梭形或多角形，少量細胞開始收縮變圓逐漸凋亡，而HeLa癌細胞幾乎全部收縮變圓逐漸凋亡(見圖1中11和15)；AO/EB雙染人臍帶正常細胞約1/2呈黃綠色熒光、1/2呈橙黃色熒光，HeLa癌細胞呈橙黃色熒光(見圖2中11和15)．0 mmol/L葡萄糖組人臍帶正常細胞仍有部分存活,但細胞輪廓發(fā)生改變，呈三角形或瘦長形，而HeLa癌細胞全部收縮變圓逐漸凋亡(見圖1中12和16)；AO/EB雙染人臍帶正常細胞仍有極少數(shù)細胞呈黃綠色熒光，HeLa癌細胞全部呈橙黃色熒光(見圖2中12和16)．

圖1 倒置顯微鏡觀察HeLa癌細胞與人臍帶正常細胞形態(tài)(Bar=50 μm)

圖2 AO/EB雙重熒光染色檢測HeLa癌細胞與人臍帶正常細胞凋亡細胞形態(tài)及數(shù)量(Bar=50 μm)

2.3 碳源饑餓對共培養(yǎng)72 h人臍帶正常細胞與HeLa癌細胞形態(tài)及凋亡的影響

共培養(yǎng)條件下對照組細胞密度增大，細胞分布均勻，貼壁性好，形態(tài)飽滿，多呈規(guī)則的梭形或多角形，折光性好(見圖1中17和21)；AO/EB雙染人臍帶正常細胞大部分呈黃綠色熒光，但有極少數(shù)呈橙黃色熒光，而HeLa癌細胞呈黃綠色熒光(見圖2中17和21)．5 mmol/L葡萄糖組人臍帶正常細胞大部分貼壁性好、形態(tài)飽滿、折光性好，僅有極少量細胞收縮變圓逐漸凋亡，而HeLa癌細胞幾乎全部收縮變圓逐漸凋亡(見圖1中18和22)；AO/EB雙染人臍帶正常細胞約1/2呈黃綠色熒光、1/2呈橙黃色熒光，HeLa癌細胞呈橙黃色熒光(見圖2中18和22)．1 mmol/L葡萄糖組人臍帶正常細胞大部分收縮變圓逐漸凋亡，仍有少數(shù)細胞存活但輪廓發(fā)生改變、折光性減弱，而HeLa癌細胞全部收縮變圓逐漸凋亡(見圖1中19和23)；AO/EB雙染人臍帶正常細胞、HeLa癌細胞全部呈橙黃色熒光(見圖2中19和23)．0 mmol/L 葡萄糖組人臍帶正常細胞與HeLa癌細胞全部收縮變圓逐漸凋亡，人臍帶正常細胞密度大于HeLa癌細胞(見圖1中20和24)；AO/EB雙染人臍帶正常細胞、HeLa癌細胞全部呈橙黃色熒光(見圖2中20和24)．

3 討 論

葡萄糖作為真核生物的主要能源物質(zhì)和新陳代謝的中間產(chǎn)物，對生物體的生長發(fā)育具有重要的作用．癌細胞的基本特征之一是細胞能量代謝異常,新陳代謝異常，葡萄糖的攝取和利用速度增加，胞外乳酸堆積增多,因此,腫瘤細胞需要大量表達GLUTs以滿足葡萄糖的超量攝入，糖酵解代謝增強，這一現(xiàn)象使得GLUT1和GLUT3成為潛在的具有診斷價值的腫瘤細胞標志物[10]．糖酵解代謝途徑為腫瘤細胞的生長提供了充足的三磷酸腺苷(ATP)，而充足的ATP又促進了腫瘤細胞的增殖與轉移．與氧化磷酸化途徑相比，糖酵解途徑的產(chǎn)能效率低，腫瘤細胞為了生成足夠的ATP，需要從細胞外環(huán)境中攝取的葡萄糖的量大約是正常細胞的10倍[3-4,11]．因此，剝奪葡萄糖的癌癥治療方法受到人們的關注．碳源饑餓是指通過降低培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度而對細胞進行饑餓處理．目前，國內(nèi)外關于碳源饑餓的研究較少．Foster等[12]用0，0.5和25 mmol/L葡萄糖濃度條件處理多種腫瘤細胞120 h，結果表明：0 mmol/L葡萄糖濃度處理組所有腫瘤細胞的生長均受到抑制；0.5 mmol/L葡萄糖濃度處理可以抑制多種腫瘤細胞的生長．文獻[13]運用長時間連續(xù)流動維持低糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)裝置對體外腫瘤細胞株進行培養(yǎng)，對低糖敏感的細胞系由于葡萄糖限制從而產(chǎn)生復雜的mtDNA基因突變或葡萄糖利用障礙，導致腫瘤生長發(fā)生異常.文獻[14]研究表明，依賴葡萄糖作為主要能量來源的癌細胞，由于線粒體氧化磷酸化途徑異常，癌細胞在低葡萄糖條件下培養(yǎng)生長受到抑制．閆珊[15]研究發(fā)現(xiàn)，缺糖能降低HeLa癌細胞的生存率，并通過調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白家族，誘導HeLa癌細胞發(fā)生凋亡．文獻[16]在葡萄糖饑餓的前提下，運用堿(如碳酸氫鈉)去除腫瘤內(nèi)的氫離子，破壞乳酸根與氫離子的協(xié)同作用，從而有效殺死葡萄糖饑餓的腫瘤細胞．

本實驗結果表明：共培養(yǎng)條件下，葡萄糖濃度為5 mmol/L時，HeLa癌細胞48 h部分凋亡，72 h幾乎全部凋亡，人臍帶正常細胞72 h時仍生長狀況良好；葡萄糖濃度為1 mmol/L時，HeLa癌細胞48 h幾乎全部凋亡，人臍帶正常細胞48 h出現(xiàn)部分凋亡，72 h時幾乎全部凋亡；葡萄糖濃度為0 mmol/L時，HeLa癌細胞24 h幾乎全部收縮變圓逐漸凋亡，人臍帶正常細胞48 h仍存活，72 h幾乎全部收縮變圓逐漸凋亡．由于HeLa癌細胞攝取葡萄糖的量顯著高于人臍帶正常細胞，葡萄糖濃度降低，HeLa癌細胞因葡萄糖供應減少而導致其增殖受到抑制．碳源饑餓可使癌細胞先于正常細胞死亡，這為碳源饑餓抗腫瘤治療提供了理論依據(jù)．

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(責任編輯 薛 榮)

Effects of glucose deprivation of HeLa cells and human umbilical cord cells

SU Jiajia， ZENG Jie， SHAO Linxiang

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

To investigate the influence of different glucose concentration medium on the morphology, growth and apoptosis of HeLa cell which were directly co-cultured with human umbilical cord cells. A control group and three experimental groups(5 mmol/L, 1 mmol/L, 0 mmol/L) were designed.After co-cultured for 24, 48, 72 h, cells were observed and took pictures under the inverted microscope and stained with AO/EB were observed under fluoroscope. The results under the inverted microscope: cells population of control group were sufficient, presented irregular and adherent growth, cone-shaped or polygonal cell body, its boundary was clear and obvious halo, and highly refractive. It was found that the numbers of cells increased gradually with the increment of glucose concentration. Cells stained with AO/EB were seen dark green or emit green. In the experimental group, the lower the glucose concentration was, the shorter the cell survival time was. Cells stained with AO/EB were gradually changed from green to orange yellow fluorescence. The same glucose concentration in human umbilical cord cells survived longer than HeLa cells. Therefore, the effect of carbon starvation on HeLa cell proliferation inhibition and induced apoptosis was more obvious than that of human umbilical cord cells. HeLa cells were more dependent on glucose than human umbilical cord cells.

glucose deprivation； HeLa cells； human umbilical cord cells; proliferation； apoptosis

10.16218/j.issn.1001-5051.2017.03.014

?2016-11-09；

2017-02-21

蘇佳佳(1992-)，女，山東濱州人，碩士研究生．研究方向:細胞生物學．

邵鄰相．E-mail： shaolinxiang@zjnu.edu.cn>

Q291

A

1001-5051(2017)03-0331-05