韓金巧， 譚江東， 王艷妮， 任 鵬，張新玉， 龔 堃， 黃相相， 周 曉

(浙江師范大學 生態(tài)研究所,浙江 金華 321004)

跨物種篩選黃毛鼠的微衛(wèi)星分子標記*

韓金巧， 譚江東， 王艷妮， 任 鵬，張新玉， 龔 堃， 黃相相， 周 曉

(浙江師范大學 生態(tài)研究所,浙江 金華 321004)

利用微衛(wèi)星引物側(cè)翼序列具有保守性的特點進行了跨物種篩選黃毛鼠微衛(wèi)星引物的研究.選取60對大鼠、小鼠已知的微衛(wèi)星位點引物,對黃毛鼠的基因組DNA進行了PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰氨凝膠電泳及基因掃描技術(shù)篩選了適合黃毛鼠的多態(tài)性位點引物.研究結(jié)果顯示，60對微衛(wèi)星位點引物中，17對引物能夠穩(wěn)定擴增，其中8對引物的多態(tài)信息含量(PIC)均大于0.5，為高度多態(tài)性引物.研究篩選到的微衛(wèi)星位點可為后期黃毛鼠的種群遺傳學研究提供參考.

黃毛鼠;微衛(wèi)星標記;跨物種擴增；多態(tài)性

黃毛鼠(Rattuslosea)隸屬于嚙齒目(Rodentia)鼠科(Muridae)大鼠屬(Rattus)，是我國華南地區(qū)水稻生產(chǎn)區(qū)重要的害鼠之一，是鉤端螺旋體、立克次體等多種病原體的儲存者和傳播者[1]，主要分布于長江以南及湖北、安徽等地區(qū)[2].目前，有關(guān)黃毛鼠生長發(fā)育[3]、年齡鑒定[4]、生態(tài)習性[5-6]、種群數(shù)量變動[7]、種群空間格局[8]及危害防治[9]等方面已有較多的研究，但利用分子生物學技術(shù)進行遺傳分析的研究報道較少.

微衛(wèi)星DNA標記是一種分子遺傳標記技術(shù)，具有共顯性遺傳、多態(tài)信息含量高、檢測快速方便、重復性好等特點，被廣泛地應用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、遺傳疾病診斷和遺傳育種等方面[10-12].目前，大鼠(Rattusnorvegicus)[13]、小鼠(Musmusculus)[14]、社鼠(Niviventerconfucianus)[15]、大倉鼠(Cricetulustriton)[16]、黑線倉鼠(Cricetulusbarabensis)[17]和長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)[18]等嚙齒動物的微衛(wèi)星引物已通過開發(fā)或篩選而獲得，但適合黃毛鼠的微衛(wèi)星引物尚未見報道.由于黃毛鼠、大鼠及小鼠都屬于鼠科動物，存在一定的親緣關(guān)系，所以，本研究采用跨物種擴增的方法，從大鼠、小鼠的微衛(wèi)星引物中篩選適合黃毛鼠的多態(tài)性引物，為進一步進行黃毛鼠遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性分析奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣本采集

分別于2013年6月和9月，采用夾捕法，在浙江省舟山群島的大摘箬山、刺山、小貓島、小盤峙島、大貓島、六橫島、桃花島及小摘箬山8個島嶼上捕捉到黃毛鼠171只，其中雄性56只、雌性115只.取適量的黃毛鼠肌肉組織，放入95%乙醇溶液中固定保存，帶回實驗室，置于-70 ℃冰箱中待處理.

1.2 組織DNA提取

取95%乙醇溶液固定保存的黃毛鼠肌肉樣品，用雙蒸水清洗樣品表面3次，用濾紙吸干表面水分.剪取肌肉組織150～200 mg，采用經(jīng)典的酚氯仿抽提法提取肌肉組織的DNA.用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取結(jié)果.

1.3 微衛(wèi)星位點選取

參照黃毛鼠的近緣種大鼠、小鼠等的微衛(wèi)星位點，選取位于大鼠和小鼠不同染色體上的60個微衛(wèi)星位點[13-15,18].微衛(wèi)星引物全部由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用TE(Tris-EDTA)緩沖液將引物稀釋至10 μmol/L，根據(jù)實驗需要取出適量，其余放入-20 ℃冰箱中保存.

1.4 PCR擴增

1.4.1 反應體系

PCR反應體系為25 μL，其中：10×PCR buffer 2.5 μL；Mg2+溶液分為1.0，1.5和2.0 μL(25 mmol/L)3個梯度進行篩選；dNTP 1.5 μL(2.5 mmol/L)；上游和下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)；樣品DNA溶液1.0 μL；rTag DNA聚合酶溶液0.2 μL(5 U/μL)；雙蒸水定容至25 μL.

1.4.2 反應程序

PCR反應在BIO-RAD公司的MyCycleTM梯度PCR擴增儀上進行.第1階段：預變性95 ℃，5 min；第2階段40個循環(huán)：變性95 ℃ 30 s,退火50～60 ℃(不同引物退火溫度不同) 35 s,延伸72 ℃ 35 s；第3階段：延伸72 ℃，7 min.

1.5 引物篩選

1.5.1 退火溫度及Mg2+濃度的確定

退火溫度及Mg2+濃度對于微衛(wèi)星引物擴增的影響較大.Mg2+濃度分為1.0，1.5，2.0 mmol/L 3個梯度;利用BIO-RAD公司的MyCycleTM梯度PCR擴增儀，設置溫度范圍為50～60 ℃，儀器自動生成8個溫度梯度：50.0，50.9，52.3，54.0，56.3，58.1，59.3和60.0 ℃，隨機抽取一個經(jīng)電泳檢測條帶較清晰的樣本DNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用加有Gold View Ⅰ型核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠、120 V電壓電泳40 min，判斷引物能否擴增及對應的最適退火溫度和Mg2+濃度.

1.5.2 引物的篩選

每個島上隨機抽取6個樣本，利用能擴增的引物，采用篩選的退火溫度及Mg2+濃度，對8個島上的48個樣本DNA進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷引物能否進行穩(wěn)定擴增.

將能夠穩(wěn)定擴增的微衛(wèi)星引物的PCR產(chǎn)物，利用BIO-RAD生產(chǎn)的DcodeTMUniversal Mutation Detection System進行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，150 V電壓預電泳40 min，點樣后250 V電壓電泳4 h，電泳結(jié)束后用10%冰醋酸溶液固定20 min，0.1%AgNO3溶液染色30 min，30 s快速水洗，顯色液(0.2 g碳酸鈉，10 g氫氧化鈉，1 mL甲醛，500 mL蒸餾水)顯色5 min，至條帶清晰時用10%冰醋酸溶液終止顯色，最后用Bio-Rad Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)進行觀察.若條帶的泳動距離一致，則說明該位點是單態(tài)位點；若泳動距離有差異，則表明該位點為多態(tài)性位點.

將初步篩選出的多態(tài)性引物的5′端分別用FAM，TAMRA和HEX進行熒光標記，對48個樣本DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行短串聯(lián)重復序列(short tandem repeats，STR)基因掃描，掃描結(jié)果采用GeneMapper ID v3.2軟件判讀，獲得擴增片段的長度.用CERVUS 3.0[19]統(tǒng)計各微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)，并計算多態(tài)信息含量(PIC)，進一步驗證引物的多態(tài)性.計算公式為

其中，Pi，Pj分別為第i和第j個等位基因的頻率.

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

利用本實驗室改善的酚-氯仿抽提法提取黃毛鼠肌肉組織的DNA.提取的DNA樣品用100 μLTE緩沖液溶解稀釋，取3 μL用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測.部分DNA的電泳結(jié)果見圖1.

2.2 退火溫度及Mg2+濃度確定

圖1 部分組織樣本DNA提取的電泳檢測結(jié)果

綜合考慮條帶的明亮、實驗成本及條帶的特異性等，最終選定每對引物最適合的Mg2+濃度及退火溫度.圖2為引物TNF的瓊脂糖凝膠電泳圖.不同引物的最適Mg2+濃度和退火溫度見表1.

2.3 微衛(wèi)星引物擴增和篩選

經(jīng)PCR反應體系優(yōu)化，60對引物中，17對引物能夠穩(wěn)定擴增，其位點名稱、引物序列、擴增條件及所在染色體見表1.其中，8對引物雜合且多態(tài)性較好，平均等位基因數(shù)為9.625(7～12),平均多態(tài)信息含量為0.811(0.696～0.871)(見表2).部分引物PCR擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果見圖3和圖4;圖5為引物IGHE的STR掃描圖.

1～8：Mg2+濃度為1.0 mmol/L，退火溫度依次降低；9～16：Mg2+濃度為1.5 mmol/L，退火溫度依次降低；17～24：Mg2+濃度為2.0 mmol/L，退火溫度依次降低；M：DM 2000圖2 引物TNF的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

序號座位引物序列(5'—3')退火溫度/℃c(Mg2+)/(mmol·L-1)所在染色體1TNFAGGAAATGGGTTTCAGTTCCCAGGATTCTGTGGCAATCTG60.01.5202FGGCAGCAACGACAAAAATGTCCATCTCCCCAACTGTCAAATG60.02.023APOC3GATTTGAAGCGATTGTCCATGTCTAGCTGCCCACAGGAG59.32.084CATCTTATGTTACCTCACAGCCT-GGGGGTGGGCCATCTTTATAATC52.32.03

續(xù)表1

表2 黃毛鼠的多態(tài)性微衛(wèi)星位點

1～15：PCR產(chǎn)物的編號;M：20 bp DNA Ladder marker圖3 引物MYC的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

1～13：PCR產(chǎn)物的編號;M：20 bp DNA Ladder marker圖4 引物IGHE的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖5 引物IGHE的STR掃描圖

3 討 論

PCR反應體系的建立和優(yōu)化是引物篩選的基礎(chǔ).影響PCR反應的主要因素有Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度及rTaq酶濃度等，退火溫度也會對擴增條帶產(chǎn)生顯著的影響.本研究對每對引物的退火溫度及Mg2+濃度進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，本實驗篩選的多態(tài)性引物退火溫度在50.9～60.0 ℃間不等，部分引物的退火溫度范圍較寬，而個別引物只能在特定的退火溫度下才能擴增出條帶.Mg2+濃度主要集中為1.5和2.0 mmol/L.綜合考慮條帶的明亮、實驗成本及條帶的特異性等，最終選定每對引物最適合的Mg2+濃度及退火溫度.PCR反應體系及反應條件的優(yōu)化是PCR反應順利進行的前提.聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)具有分辨率高、不易擴散、熱穩(wěn)定、易于觀察和靈敏度高等優(yōu)點，已被廣泛應用于核酸與蛋白質(zhì)的分離，特別是在SSR，AFLP，SNP等分子標記研究中具有極其重要的作用.雖然PAGE技術(shù)操作步驟繁瑣復雜、費時費工，但不失為初步篩選多態(tài)性引物的較節(jié)約成本的有效方法.STR基因掃描技術(shù)相比聚丙烯酰胺電泳技術(shù)的結(jié)果更加準確客觀，可以檢測到微小片段的差異，得到更準確的等位基因數(shù)，以進一步檢驗微衛(wèi)星引物的多態(tài)性[20].

自從1991年Moore等[21]發(fā)現(xiàn)了哺乳動物基因組中的微衛(wèi)星側(cè)翼保守序列后，對于相同屬、科、目的不同物種的跨種擴增篩選微衛(wèi)星位點的方法得到了證實.吳云良等[22]利用16對家貓微衛(wèi)星引物和4對蘇門答臘虎微衛(wèi)星引物，篩選出15對具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星引物，并有效地檢測了東北虎的遺傳多樣性及親緣關(guān)系；孫波等[15]利用大鼠和小鼠的微衛(wèi)星引物對社鼠的基因組DNA進行了擴增，擴增的同源率達到30%；包文斌等[23]利用29對雞的微衛(wèi)星標記對孔雀基因組DNA進行了跨種擴增，發(fā)現(xiàn)14對引物能擴增出穩(wěn)定的特異性條帶，且7對引物具有較豐富的多態(tài)性，并成功利用篩選的微衛(wèi)星標記對藍孔雀和綠孔雀群體間和群體內(nèi)的遺傳多樣性進行了分析.本研究選取60對大鼠和小鼠已知的微衛(wèi)星位點引物，對黃毛鼠的基因組DNA進行了擴增，研究結(jié)果顯示，60對微衛(wèi)星位點引物中，17對引物能夠穩(wěn)定擴增，其中8對引物的多態(tài)信息含量(PIC)大于0.5，為高度多態(tài)性引物，能夠客觀地分析黃毛鼠種群的遺傳變異情況.由此可見，微衛(wèi)星跨種擴增的方法簡單、操作方便，是一種有效快速的方法，對于種群遺傳學的研究具有一定指導意義.

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(責任編輯 薛 榮)

Cross-species amplication of microsatellite loci inRattuslosea

HAN Jinqiao, TAN Jiangdong, WANG Yanni, REN Peng,ZHANG Xinyu, GONG Kun, HUANG Xiangxiang, ZHOU Xiao

(InstituteofEcology,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

Based on the conservatism of microsatellite flanking sequences, cross-species amplication of microsatellite loci was an effective method. 60 microsatellite markers of rat (Rattusnorvegicus) and mouse (Musmusculus) were screened forRattusloseathrough PCR amplification, polyacrylamide gel electrophoresis and gene scanning technique. The results showed that 17 microsatellite loci could be amplified stably and 8 of them were highly polymorphic, and the polymorphism information content (PIC) was more than 0.5. These microsatellite loci would provide a reference for the later research on the population genetics ofRattuslosea.

Rattuslosea; microsatellite loci; cross-species amplication; polymorphism

10.16218/j.issn.1001-5051.2017.03.011

?2016-03-01；

2017-12-21

國家自然科學基金資助項目(31200323)

韓金巧(1990-)，女，山西汾陽人，碩士研究生.研究方向：生物多樣性保護.

王艷妮.E-mail: wangyn@zjnu.cn>

Q959.837

A

1001-5051(2017)03-0312-06