王明爽，徐晶

（1.通化師范學院長白山食用植物資源開發(fā)工程中心，吉林通化134002；2．通化師范學院制藥與食品科學學院，吉林通化134002）

長白山榛仁蛋白水解物的制備工藝研究

王明爽1，2，徐晶1，2

（1.通化師范學院長白山食用植物資源開發(fā)工程中心，吉林通化134002；2．通化師范學院制藥與食品科學學院，吉林通化134002）

以長白山榛仁分離蛋白為原料，用堿性蛋白酶Alcalase水解制備榛仁蛋白水解物，通過對水解過程中的加酶量、pH、溫度和底物濃度等因素進行單因素和響應面試驗，優(yōu)化得出榛仁蛋白水解物的最佳水解工藝為：加酶量10 000 U/g，pH8.5，溫度53.5℃，底物濃度2.0%，水解時間150 min，在此條件下制備的榛仁蛋白水解物的水解度達39.72%。

長白山榛仁；蛋白水解物；響應面

榛子（Corylus heterophylla Fisch.），為樺木科榛屬植物，在世界范圍內(nèi)有約20個榛屬品種。作為國際知名的四大堅果之一，野生榛子廣泛分布在我國長白山地區(qū)，最知名的種類是平榛和毛榛，特別是平榛，更為知名[1-2]。榛仁營養(yǎng)豐富，含脂肪高達57.1%～62.1%，蛋白質達16.2%～21.12%，碳水化合物6.5%～9.3%，還含有維生素C、維生素E和多種礦物質[3]。榛仁粕是榛子榨油后的副產(chǎn)品，富含蛋白質，卻被主要用作動物飼料，粕的利用價值低，造成優(yōu)質蛋白資源的浪費[4]。

據(jù)報道，酶水解可以通過將蛋白質轉化為具有所需大小、電荷和表面性質的肽從而改善飲食蛋白質的功能性質且不影響其營養(yǎng)價值[5]。近年來，國內(nèi)外大量研究表明，動物或植物蛋白質經(jīng)蛋白酶水解后可產(chǎn)生多種具有有益生理活性的物質，如牛奶[6]、乳清[7]、大豆[8]、魚卵[9-10]等的蛋白質水解物具有免疫調(diào)節(jié)功能；玉米[11]、花生[12]、大米[13]、菜籽[14]等的蛋白質水解物具有抗氧化活性和ACE抑制活性。

蛋白質的水解是以水解度（DH）衡量的，DH是決定蛋白質水解產(chǎn)物功能性質的重要參數(shù)。DH影響肽的大小并因此影響肽的氨基酸組成，受DH影響的氨基酸組成的變化也可以調(diào)節(jié)水解期間形成的肽的生物活性[5]。本研究以長白山榛仁分離蛋白為原料，以水解度為判定指標，優(yōu)化長白山榛仁蛋白水解物的制備工藝，以期提高長白山榛子資源的綜合利用開發(fā)，為長白山野生榛仁水解肽的深入研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山榛仁分離蛋白（蛋白含量為94.4%）：吉林農(nóng)業(yè)大學食品學院實驗室自制；Alcalase 2.4L FG：丹麥諾維信公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

XMTD-8222型水浴鍋：精宏儀器公司；BSA224S型分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；ZD-2型自動電位滴定儀：上海儀電科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榛仁蛋白水解物的制備

將一定質量的榛仁分離蛋白加入100 mL蒸餾水中，配成所需濃度的蛋白溶液，于100℃水浴鍋中放置15 min，充分破壞蛋白結構，快速冷卻后放入恒溫水浴鍋中，用0.6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至所需pH值后，加入一定量的Alcalase，不停地搖晃瓶身以保證水解充分，用自動電位滴定儀滴加NaOH溶液維持pH值恒定，水解一定時間后記錄消耗的NaOH溶液體積，計算水解度。

1.3.2 榛仁蛋白水解物制備的單因素試驗

選取加酶量、pH值、溫度、底物濃度等4個因素作為單因素，分別設置5個水平，考察各因素對榛仁蛋白水解物水解度大小的影響，初步確定各因素的最適水解條件。

1.3.3 榛仁蛋白水解物制備的響應面試驗

以單因素試驗結果為基礎，利用Design Expert 8.0分析軟件中的Box-Behnken中心組合試驗原理，選取對榛仁蛋白水解物水解度影響較大的因素，即加酶量、pH值、溫度，設計三因素三水平的響應面試驗，以水解度為響應值，優(yōu)化榛仁蛋白水解物的水解條件。

1.3.4 水解度（DH）測定

水解度的測定采用pH-stat法進行測定[15]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 加酶量對水解度的影響

在水解pH8.0、溫度50℃、底物濃度2.0%、水解時間150 min的條件下，不同加酶量對榛仁蛋白水解物水解度的影響結果見圖1。

如圖1所示，隨著加酶量的增加，Alcalase水解榛仁分離蛋白的水解度呈現(xiàn)上升趨勢，當加酶量為8 000 U/g時，水解度為37.72%，繼續(xù)增大加酶量至10 000 U/g，水解度的增加幅度很小。隨著加酶量的增加，水解反應的速度加快，大部分蛋白質在較短時間內(nèi)被水解為小分子多肽，當?shù)鞍踪|減少到一定程度時，體系中多余酶的作用底物主要是小分子多肽，體現(xiàn)為反應體系的水解度增幅趨于平緩[16]，因此Alcalase水解榛仁分離蛋白的最適加酶量選擇8 000 U/g。

圖1 加酶量對水解度的影響Fig.1 Effect of Alcalase volume on degree of hydrolysis

2.1.2 pH對水解度的影響

在加酶量8 000 U/g、水解溫度50℃、底物濃度2.0%、水解時間150 min的條件下，不同pH值對榛仁蛋白水解物水解度的影響結果見圖2。

圖2 pH值對水解度的影響Fig.2 Effect of pH on degree of hydrolysis

堿性蛋白酶Alcalase在偏堿性條件下能夠發(fā)揮更好的水解作用，由圖2可以看出，pH值對榛仁蛋白水解物水解度的影響呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，最佳pH值為9.0，水解度達38.10%，因此選擇pH9.0作為Alcalase水解榛仁分離蛋白的最適pH值。

2.1.3 溫度對水解度的影響

在加酶量8 000 U/g、pH8.5、底物濃度2.0%、水解時間150 min的條件下，不同溫度對榛仁蛋白水解物水解度的影響結果見圖3。

水解過程中的溫度對蛋白酶分子穩(wěn)定性的影響很大，水解溫度過高，會使蛋白酶分子的次級鍵發(fā)生解離，導致蛋白酶失活，水解溫度低，則使反應體系的分子運動減慢，蛋白酶與底物的作用幾率降低，降低水解反應速度[17]。由圖3可以看出，堿性蛋白酶Alcalase水解榛仁分離蛋白的最適水解溫度為55℃，水解度達39.58%。

圖3 溫度對水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on degree of hydrolysis

2.1.4 底物濃度對水解度的影響

在加酶量8 000 U/g、pH8.5、水解溫度50℃、水解時間150 min的條件下，不同底物濃度對榛仁蛋白水解物水解度的影響結果見圖4。

圖4 底物濃度對水解度的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on degree of hydrolysis

底物濃度過低時，蛋白酶分子與底物的結合幾率降低，但底物濃度過高，溶液的粘度增大，影響蛋白酶擴散，抑制水解反應進行[18]。由圖4可以看出，底物濃度對榛仁蛋白水解物水解度的影響不是非常明顯，但也顯示出先增高后降低的趨勢，在2.0%時水解度達到最大值，因此選擇2.0%作為水解榛仁分離蛋白的最佳底物濃度。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗模型的建立及分析

由于底物濃度的變化對水解度的影響較小，因此在響應面試驗中不對此因素進行優(yōu)化，選取水解pH、溫度和加酶量3個因素進行響應面分析。利用Box-Behnken中心組合設計因素水平編碼表，共計17組試驗，試驗測定結果如表1所示。

利用Design-Expert8.0分析軟件對表1中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，建立回歸方程如下：水解度/%=37.04-2.3A-0.93B+0.94C-1.17AB+0.13AC-8.88×10-3BC-1.63A2+0.79B2-0.054C2

表1 響應面試驗設計及結果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

該模型的方差分析結果如表2所示。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance for regression model

由表2可以看出，所建立的二次回歸模型極顯著（p＜0.01），失擬項不顯著，說明模型與試驗值結果擬合較好，具有代表性。表中A和A2項達到了極顯著水平，B、C和AB項達到了顯著水平，模型R2=0.946 5、Radj2=0.877 7，說明自變量和響應值之間線性關系顯著，可將該模型用于榛仁分離蛋白水解工藝的理論推測。

各因素對榛仁蛋白水解物水解度的交互作用如圖5所示，直觀反映了各因素對響應值的影響。

圖5 加酶量、pH和溫度交互作用影響水解度的響應曲面圖Fig.5 Response surface plots of mutual influence of three hydrolysis parameters on degree of hydrolysis

2.2.2 榛仁蛋白水解物制備工藝條件的確定

由Design-Expert分析得到Alcalase水解榛仁分離蛋白的最佳工藝條件為：加酶量10 000 U/g，pH8.5，溫度53.47℃，底物濃度2.0%，模型預測的水解度可達39.81%。響應面回歸模型的方差分析表明擬合較好?？紤]到實際操作的情況，將條件修正為：加酶量10 000 U/g，pH8.5，溫度 53.5℃，底物濃度 2.0%，在此條件下做驗證試驗，計算水解度為39.72%，與模型預測值較吻合，說明得到的水解工藝條件可靠，可用于進一步的研究。

3 結論

本試驗以長白山榛仁分離蛋白為原料，用堿性蛋白酶Alcalase水解，通過響應面試驗優(yōu)化榛仁蛋白水解物的制備工藝。確定了榛仁蛋白水解物的最佳水解工藝條件為：加酶量10 000 U/g，pH8.5，溫度53.5℃，底物濃度2.0%，水解度達39.72%。響應面優(yōu)化后提高了榛仁蛋白水解物的水解度，這有利于榛仁蛋白水解物生物活性的進一步研究，為榛仁蛋白開發(fā)功能性食品和保健食品提供參考。

[1] Xin C,Li-song L,Qing-hua M,et al.Cloning and expression characteristics of a novel dehydrin gene from hazelnut(Corylus heterophylla Fisch.)[J].Acta Horticulturae Sinica,2013,40(1):32-40

[2]Liu J,Cheng Y,Yan K,et al.The relationship between reproductive growth and blank fruit formation in Corylus heterophylla Fisch[J].Scientia Horticulturae,2012,136:128-34

[3] 田文翰.不同品種榛子營養(yǎng)品質的分析[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學,2012.

[4] Usta N,?ztürk E,Can ?,et al.Combustion of biodiesel fuel produced from hazelnut soapstock/waste sunflower oil mixture in a diesel engine[J].Energy Conversion and Management,2005,46(5):741-55

[5] Kristinsson,H.G.,&Rasco,et al.Fish protein hydrolysates:Production,biochemical,and functional properties[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2000,40:43-81

[6] Pan D D,Wu Z,Liu J,et al.Immunomodulatory and hypoallergenic properties of milk protein hydrolysates in ICR mice[J].Journal of dairy science,2013,96(8):4958-4964

[7] Mercier A,Gauthier S F,Fliss I.Immunomodulating effects of whey proteins and their enzymatic digests[J].International Dairy Journal,2004,14(3):175-183

[8] Kong X Z,Guo M M,Hua Y F,et al.Enzymatic preparation of immunomodulatinghydrolysates from soy proteins[J].BioresourceTechnology,2008,99(18):8873-8879

[9] Chalamaiah M,Hemalatha R,Jyothirmayi T,et al.Immunomodulatory effects of protein hydrolysates from rohu(Labeo rohita)egg(roe)in BALB/c mice[J].Food Research International,2014,62:1054-1061

[10]Chalamaiah M,Hemalatha R,Jyothirmayi T,et al.Chemical composition and immunomodulatory effects of enzymatic protein hydrolysates from common carp(Cyprinus carpio)egg[J].Nutrition,2015,31(2):388-398

[11]朱麗娟.玉米蛋白水解物體外消化產(chǎn)物的抗氧化及ACE抑制活性研究[D].無錫:江南大學,2008

[12]Jamdar S N,Rajalakshmi V,Pednekar M D,et al.Influence of degree of hydrolysis on functional properties,antioxidant activity and ACEinhibitoryactivityofpeanut protein hydrolysate[J].Food Chemistry,2010,121(1):178-184

[13]陳倩倩,佟立濤,鐘葵,等.大米蛋白酶解物的ACE抑制活性研究[J].現(xiàn)代食品科技,2015(3):91-96,90

[14]何海艷,楊愛萍,何榮.菜籽蛋白水解物及其分離組分抗氧化性研究[J].糧食與食品工業(yè),2016,23(2):50-56

[15]周慧江,朱振寶,易建華.核桃蛋白水解物水解度測定方法比較[J].糧食與油脂,2012(2):28-30

[16]郭慶啟,張娜,姜元松,鄒傳山.榛子仁蛋白酶解工藝的優(yōu)化及酶解物抗氧化能力的研究[J].食品科學,2013(9):189-193

[17]Siriwardhana S S K W,Shahidi F.Antiradical activity of extracts of almond and its by-products[J].Journal of the American Oil Chemists'Society,2002,79(9):903-908

[18]李莉.松仁多肽的制備及其免疫活性研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學,2008

Study on Preparation of Changbai Mountain Hazelnut Protein Hydrolysates

WANG Ming-shuang1，2，XU Jing1，2
（1.Development Engineering Center of Edible Plant Resources of Changbai Mountain，Tonghua Normal University，Tonghua 134002，Jinlin，China；2.Department of Pharmaceutics and Food Science，Tonghua Normal University，Tonghua 134002，Jinlin，China）

This paper took Changbai Mountain hazelnut protein isolated as raw material，prepared the hazelnut protein hydrolysates using the Alcalase，through the single factor and response surface experiment of the Alcalase volume，pH，temperature and substrate concentration，the optimal hydrolysis conditions were determined as：Alcalase volume 10 000 U/g，pH 8.5，temperature 53.5℃，substrate concentration 2.0%，hydrolysis time 150 min，the degree of hydrolysis of hazelnut protein hydrolysates reached 39.72%.

Changbai Mountain hazelnut；protein hydrolysates；response surface

2016-12-12

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.024

王明爽（1990—），女（滿），助教，碩士，研究方向：生物轉化與利用。