趙思俊，曲 萍，李 洋，張 蕻

（1.山西省食品藥品檢驗所，山西太原030001； 2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西太原030006）

小鼠酚紅排泌實驗影響因素的考察

趙思俊1，2，曲 萍1，李 洋1，張 蕻1

（1.山西省食品藥品檢驗所，山西太原030001； 2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西太原030006）

目的：對小鼠酚紅排泌實驗的主要影響因素進行考察，提高小鼠酚紅排泌實驗的規(guī)范性。方法：通過對動物的品系、體質(zhì)量、實驗前禁食與否、處死時間、酚紅濃度等可能影響酚紅排泌實驗的因素逐一進行考察。結(jié)果：動物的品系、體質(zhì)量、處死時間對該實驗有影響，實驗前禁食與否、酚紅濃度對該實驗無影響。結(jié)論：通過控制實驗影響因素能完善小鼠酚紅排泌實驗方法。

酚紅；排泌；模型小鼠

酚紅排泌是實驗藥理學(xué)中祛痰的經(jīng)典實驗之一，該方法被廣泛應(yīng)用于新藥篩選和藥效學(xué)評價，但是，目前的文獻報道中該實驗方法并不統(tǒng)一［1-4］，影響實驗結(jié)果，給研究人員帶來極大的困惑和浪費。為規(guī)范和增加該實驗的重現(xiàn)性，提高成功率，我們針對該實驗的影響因素逐一進行了考察，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18~22 g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗研究中心提供，合格證號：SCXK-（軍）2012-0004。實驗期間室溫22℃~25℃，相對濕度40%~60%，12 h/12 h交替照明，自由攝食飲水。

1.1.2 試劑與儀器 苯酚紅，天津市光復(fù)精細化工研究所，批號20140530；其他試劑均為分析純，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供。Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）。

1.2 實驗方法

取昆明種健康小鼠，每組10只，雌雄各半。實驗前禁食不禁水12 h，于最后一次給藥后30 min腹腔注射1%酚紅生理鹽水50 mL/kg。注射酚紅1 h后，處死動物，剪開頸前皮膚，剝離氣管周圍組織，剪下甲狀軟骨下緣至氣管分叉處的一段氣管，放入盛有2 mL生理鹽水與5%碳酸氫鈉溶液0.1 mL中，旋渦振蕩1 min，波長546 nm處測吸光度值［5-7］。

1.2.1 動物品系對實驗結(jié)果的影響 取KM、ICR、NIH種小鼠各10只，其余按上法操作。

1.2.2 動物體質(zhì)量對實驗結(jié)果的影響 取初始體質(zhì)量15~18 g，18~22 g，23~30 g，30~35 g小鼠各10只，其余按上法操作。

1.2.3 酚紅濃度對實驗結(jié)果的影響 取小鼠40只，隨機分成4組，腹腔注射不同濃度的酚紅溶液，①0.5%、100 mL/kg；②1%、50 mL/kg；③2.5%、20 mL/kg，其余按上法操作。

1.2.4 禁食與否對實驗結(jié)果的影響 取小鼠20只，隨機分成2組，一組實驗前禁食，另一組不禁食，其余按上法操作。

1.2.5 處死時間對實驗結(jié)果的影響 取小鼠20只，隨機分成2組，一組處死時間為30 min，另一組處死時間為1 h，其余按上法操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以吸光度值的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物品系對實驗結(jié)果的影響

結(jié)果見表1。

表1 不同品系小鼠對實驗結(jié)果的影響 （±s）

表1 不同品系小鼠對實驗結(jié)果的影響 （±s）

品系 n KM 10 ICR 10 NIH 10 OD值 F P 0.112 3±0.035 1 8.262 ＜0.001 0.054 8±0.040 2 0.112 9±0.034 5

結(jié)果如表1所示，ICR種小鼠與KM種小鼠、NIH種小鼠OD值比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01），其OD值偏小，表明動物品系對實驗結(jié)果有影響，由于KM小鼠被廣泛應(yīng)用于藥理毒理評價，較易獲得且價格便宜，故建議進行該實驗可優(yōu)先選用KM小鼠。

2.2 動物體質(zhì)量對實驗結(jié)果的影響

除了18~22 g與23~30 g兩組以外，其他任何2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明動物體質(zhì)量對實驗結(jié)果有明顯影響?？紤]到中藥藥理實驗中給藥時間較長，動物體質(zhì)量偏大，影響小鼠對酚紅排泌的敏感性，建議選用初始體質(zhì)量為18~22 g小鼠。結(jié)果見表2。

表2 不同體質(zhì)量小鼠對實驗結(jié)果的影響 （±s）

表2 不同體質(zhì)量小鼠對實驗結(jié)果的影響 （±s）

體重（g） n 15~18 10 18~22 10 23~30 10 0.270 5±0.023 9 0.266 4±0.024 1 30~35 10 OD值 F P 0.132 3±0.050 6 12.364 ＜0.001 0.204 1±0.034 5

2.3 酚紅濃度對實驗結(jié)果的影響結(jié)果見表3。

表3 不同酚紅濃度對實驗結(jié)果的影響 （±s）

表3 不同酚紅濃度對實驗結(jié)果的影響 （±s）

濃度（%）0.5 1.0 2.5 n 體積（mL/kg）10 100 10 50 10 20 OD值 F P 0.227 3±0.073 8 1.903＞0.05 0.174 4±0.070 6 0.244 3±0.102 6

結(jié)果如表3所示，在預(yù)實驗過程中還考察了5 %酚紅溶液，其容易分層，溶解不徹底，注射難度較大，故未進行該濃度的實驗。雖然0.5%、1.0%、2.5%的酚紅對該實驗結(jié)果無影響，但是，考慮到注射體積的可操作性，建議選用1.0%的酚紅溶液，50 mL/kg。

2.4 禁食與否對實驗結(jié)果的影響

結(jié)果見表4。

表4 禁食與否對實驗結(jié)果的影響 （±s）

表4 禁食與否對實驗結(jié)果的影響 （±s）

禁食情況 n禁食 10未禁食 10 OD值 t P 0.114 7+0.041 2 1.922 ＞0.05 0.079 2+0.038 8

結(jié)果如表4所示，實驗前小鼠禁食與未禁食比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但禁食狀態(tài)下的吸光度值較未禁食狀態(tài)下測定更準(zhǔn)確，同時為了避免食物對酚紅排泌量造成影響，導(dǎo)致實驗測定結(jié)果不準(zhǔn)確，故建議選用禁食狀態(tài)。

2.5 處死時間對實驗結(jié)果的影響

結(jié)果見表5。

表5 不同處死時間的影響 （±s）

表5 不同處死時間的影響 （±s）

處死時間 n 30 min 10 1 h 10 OD值 t P 0.107 9±0.072 1 -3.525 ＜0.05 0.276 8±0.070 9

結(jié)果如表5所示，處死時間為1 h測定的吸光度值更符合紫外-可見分光光度計的數(shù)據(jù)要求，標(biāo)準(zhǔn)差較小，而處死時間為30 min測定的數(shù)據(jù)偏小，同時考慮到解剖操作時間的合理性，建議選擇處死時間為1 h。

3 討論

利用酚紅作為祛痰效果指示劑，在祛痰藥的影響下，隨著支氣管分泌液的增加，由呼吸道黏膜排出的酚紅越多，表現(xiàn)為支氣管灌洗液中酚紅濃度越高［7］。由于本實驗主要是考察各影響因素，故采用吸光度值代替酚紅排出量給予報道，由于兩者統(tǒng)計結(jié)果一致，并不影響實驗的結(jié)論。

本文對動物的品系、體質(zhì)量、實驗前禁食與否、處死時間、酚紅濃度等可能影響酚紅排泌實驗的因素逐一進行了考察，實驗結(jié)果顯示：實驗前禁食與否、酚紅濃度對該實驗無影響；動物的品系、體質(zhì)量、處死時間對該實驗有影響。

根據(jù)考察的影響因素，得到該實驗的最優(yōu)方法：實驗前各組小鼠禁食不禁水12 h，于末次給藥后30 min腹腔注射1.0%酚紅生理鹽水50 mL/kg。注射酚紅1 h后，處死動物，剪開頸前皮膚，剝離氣管周圍組織，剪下甲狀軟骨下緣至氣管分叉處的一段氣管，放入盛有2 mL生理鹽水、5%碳酸氫鈉溶液0.1 mL中，旋渦振蕩1 min，隨即用酶標(biāo)儀在波長546 nm處測吸光度值。

［1］朱智強，牛勃，謝秋，等.地龍祛痰制劑的止咳祛痰抗炎作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2014，25（10）：2 379-2 381.

［2］楊鴻，孔冬冬.金黃止咳顆粒的止咳化痰抗炎作用實驗研究［J］.中國藥物警戒，2014，11（6）：325-330.

［3］鄧恢進，李霞，張金美，等.苦橘咳喘合劑的止咳化痰作用與急性毒性［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2015，34（5）：603-605.

［4］陳常蓮，吳香杰，布和巴特爾，等.蒙藥材懸鉤子木不同溶劑提取物的鎮(zhèn)咳祛痰作用比較研究［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2014，6（6）：41-42.

［5］徐叔云，卞如濂.藥理實驗方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：1 165.

［6］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：625-626.

［7］李儀奎.中藥藥理實驗方法學(xué)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：428.

（編輯：翟春濤）

Study on the influence factors of phenolsulfonphthalein excretion in mice

Zhao Sijun1，2，Qu Ping1，Li Yang1，Zhang Hong1
（1.Shanxi Institute for Food and Drug Control，Taiyuan Shanxi 030001；2.Modern Research Center for Traditinal Chinese Medicine，Shanxi University，Taiyuan Shanxi 030006）

Objective：To study the main influence factors of phenolsulfonphthalein excretion in mice to improve the standardization and reproducibility of the model mice.Methods：Factors that may affect the phenolsulfonphthalein excretion suchasthebreedsofmouse，bodyweight，fastingbeforeexperimentornot，thetimeofkillingthemouseandphenolsulfonphthalein concentration were invested.Results：The breeds of mouse，the weight of mouse and the time of killing mouse have effects on the experiment while fasting before the experiment or not and phenolsulfonphthalein concentration have no effect.Conclusion：Phenolsulfonphthalein excretion experiment method in mice can be improved by controlling the experimental factors.

phenolsulfonphthalein；excretion；the model mouse

R285.5

A

1671-0258（2017）04-0005-03

山西省實驗動物專項資金項目（2014k14）

趙思俊，碩士，主管藥師，研究方向為中藥藥理，E-mail：zsj4429731@163.com

●“實驗”雖然是現(xiàn)代科學(xué)研究常用的方法，然在我國卻自古有之。古代學(xué)者王沖說“等類眾多，行事比肩，略舉較著，以定實驗也”，顏之推說“昔在江南，不信有千 人帳，及來河北，不信有二萬斛船，皆實驗也”，大凡此義均與現(xiàn)代科學(xué)意義上的experiment相通。照此，傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)并非只是經(jīng)驗之學(xué)，而更充滿實驗的思想和方法。實驗中醫(yī)藥學(xué)，將現(xiàn)代實驗科學(xué)的方法和傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)的實驗方法融合起來，開拓現(xiàn)代實驗生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥物科學(xué)的新領(lǐng)域。