梁姍，徐波，劉歡，曹顏，蔣子川

（長江師范學院生命科學與技術(shù)學院，重慶408100）

胭脂蘿卜花青素的酶法提取及抑菌活性研究

梁姍，徐波，劉歡，曹顏，蔣子川

（長江師范學院生命科學與技術(shù)學院，重慶408100）

為研究酶法提取胭脂蘿卜花青素的工藝條件，考察了纖維素酶-果膠酶比例、酶用量、酶解時間、酶解溫度、pH值5個單因素對花青素提取率的影響。采用中心組合設計及響應面分析得出酶法提取胭脂蘿卜花青素最佳工藝為：果膠酶與纖維素酶比例1∶2（質(zhì)量比）、添加量0.03 mg/g，在50℃下，pH 4.0，酶解95 min。在此條件下，花青素的最高提取量為4.25 mg/g。采用分光光度法和牛津杯進行抑菌試驗，結(jié)果表明，胭脂蘿卜花青素對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌均有抑制作用，最低抑菌濃度分別為0.8%、1.6%、1.6%。

胭脂蘿卜；花青素；酶法提??；抑菌活性

花青素（anthocyanin）是存在于植物中的水溶性天然色素，在自然狀態(tài)下往往與各種糖苷形成花色苷[1-3]。近年研究表明其具有較強的抑菌活性，鄧紅梅等[4]發(fā)現(xiàn)野生葡萄皮渣花青素對金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用。張俊等[5]發(fā)現(xiàn)紫蘿卜花青素能抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，褚盼盼等[6]發(fā)現(xiàn)黑豆皮花青素對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，郝文博和古榮鑫等[7-8]發(fā)現(xiàn)藍莓及紫甘薯花青素對大腸桿菌均有較強抑制作用。胭脂蘿卜（carmine radish）是重慶市涪陵特有的蔬菜品種，富含花青素類天竺葵素。本研究探討了酶法提取胭脂蘿卜花青素的最佳工藝及其抑菌活性，以期為胭脂蘿卜花青素的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胭脂蘿卜品種為胭脂紅1號，由長江師范學院生命科學與技術(shù)學院保存；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、白色念珠菌、黑曲霉來自于長江師范學院微生物實驗室；AB-8大孔樹脂：東鴻化工有限公司。無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸鋁、鹽酸、氯化鈉（均為國產(chǎn)分析純）：重慶川東化工有限公司；纖維素酶，果膠酶：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺（ZHJH-C1112CZ）：上海智城分析儀器制造有限公司；高速冷凍離心機（TGL-16M）：湖南湘儀儀器制造有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082）：上海一恒科學儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A）：上海亞榮儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法提取花青素

新鮮胭脂蘿卜洗干凈，均勻切成2 mm薄片，60℃烘干到恒重，粉碎并過40目篩，避光常溫保存。稱取胭脂蘿卜粉1.0 g，以100 mL的去離子水（pH 7.0）溶解，加入復合酶（纖維素酶-果膠酶）進行酶解，調(diào)節(jié)酶解pH值與時間，過濾去除濾渣，以3 000 r/min，離心10 min，取上清，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除液體，以去離子水溶解花青素并定容1至100 mL測定胭脂蘿卜花青素含量。

1.3.2 花青素含量測定

采用宋德群等報道的pH示差法計算花青素含量[9]。計算公式為：

式中：p為花青素含量，mg/g；A0和 A1分別 pH 1.0、pH 4.5時花青素在520 nm處的吸光度；V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為天竺葵素-3-槐二糖苷相對分子量（648.5）；ε為消光系數(shù)（30 200）；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗設計

分別探究果膠酶∶纖維素酶（質(zhì)量比）為 3∶1、2∶1、1∶1、2∶1、3∶1；復合酶用量（mg/g）：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05；酶解 pH：3.0、3.5、4.0、4.5、5.0；酶解時間（min）：30、60、90、120、150；酶解溫度（℃）：35、40、45、50、55 對胭脂蘿卜花青素提取量的影響。

1.3.4 響應面法試驗設計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以復合酶用量（A）、酶解時間（B）、酶解pH（C）這3個因素為自變量，以胭脂蘿卜花青素提取量為響應值，利用Box-Behnken組合設計試驗方法[12]，進行對提取胭脂蘿卜花青素條件的優(yōu)化，因素水平見表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.3.5 胭脂蘿卜花青素的樹脂純化

在層析柱中加入預處理好的AB-8大孔樹脂，加入花青素提取液，吸附達飽和（流出的液體和流進的花青素吸光度值相同），用蒸餾水反復沖洗樹脂，直到流出的液體無白色或褐色渾濁為止。以1%鹽酸乙醇進行解析，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃回收乙醇，得到花青素純化液。

1.3.6 胭脂蘿卜花青素抑菌活性

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠沙門氏菌、金黃色葡萄球菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，黑曲霉、白色念珠菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。取純化后的花青素溶液稀釋至5 mg/mL，6種供試菌種的菌液中分別加入10 mL花青素和10 mL無菌水（對照）進行培養(yǎng)，細菌37℃培養(yǎng)24 h，霉菌28℃培養(yǎng)2 d。用可見分光光度計在520 nm處分別測定處理組和對照組各菌懸液的吸光值。利用牛津杯法測量抑菌圈的大小[10]。根據(jù)菌懸液的吸光值和抑菌圈的大小綜合得出胭脂蘿卜花青素對供試菌的抑菌效果[11-12]。

1.3.7 胭脂蘿卜花青素的最小抑菌濃度（MIC）

將胭脂蘿卜花青素和各菌懸液按比例加入試管中，使試管中的抑菌劑質(zhì)量濃度為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%。細菌于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，霉菌于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)基中沒有細菌生長的最低濃度即為最小抑菌濃度[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 復合酶比例對花青素提取量的影響

復合酶比例對花青素提取量的影響見圖1。

圖1 復合酶比例對花青素提取量的影響Fig.1 Effect of the ratio of compound enzyme on anthocyanin content

當果膠酶∶纖維素酶為3∶1（質(zhì)量比）時，花青素提取量最低，果膠酶∶纖維素酶為1∶2（質(zhì)量比）時，花青素的提取量達到最高，說明纖維素酶在胭脂蘿卜酶解過程中更為重要，可能與蘿卜中纖維素含量較高有關(guān)。

2.1.2 復合酶用量對花青素提取量的影響

復合酶用量對花青素提取量的影響見圖2。

圖2 復合酶用量對花青素提取量的影響Fig.2 Effect of the enzyme dosage on the anthocyanin content

隨著酶用量從0.01 mg/g增加至0.03 mg/g，花青素的提取量也增加，當酶用量超過0.03 mg/g后，花青素提取量并未增加，反而有降低的趨勢，可能是0.03 mg/g酶用量已使細胞壁的降解達到最大化，因此最佳的復合酶用量為0.03 mg/g。

2.1.3 酶解pH值對花青素提取量的影響

酶解pH值對花青素提取量的影響見圖3。

圖3 酶解pH值對花青素提取量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis pH on anthocyanin content

隨著復合酶pH值從3.0到4.0，花青素提取量達到最高，超過pH 4.0，花青素的提取量降低，可能是由于高pH值影響了酶的活性，從而影響了花青素的提取量。果膠酶的最適pH值為3.0左右，纖維素酶最適pH值為5.0左右，因此，復合酶采用pH 4.0也是較適宜的。

2.1.4 酶解時間對花青素提取量的影響

酶解時間對花青素提取量的影響見圖4。

90 min以內(nèi)，隨著酶解時間的增加花青素的提取量也增加，90 min～150 min時，花青素的提取量隨酶解時間的增加反而減少，說明90 min已足夠使花青素完全溶出。

2.1.5 酶解溫度對花青素提取量的影響

酶解溫度對花青素提取量的影響見圖5。

花青素提取量隨著酶解溫度的上升而提高，在50℃時達到最高，隨后酶解溫度的升高反而引起花青素提取量降低?？赡苁怯捎谶^高的溫度使酶活性降低，同時導致花青素部分降解。果膠酶與纖維素酶的最適溫度均為50℃左右，因此復合酶采用50℃也是較適宜的。

圖4 酶解時間對花青素提取量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on anthocyanin content

圖5 酶解溫度對花青素提取量的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on anthocyanin content

2.2 響應曲面法優(yōu)化試驗結(jié)果

基于單因素試驗結(jié)果，選取復合酶用量（A）、酶解時間（B）、酶解pH值（C）進行響應面分析，結(jié)果見表2。

表2 響應面分析方案及實驗結(jié)果Table 2 Response surface analysis and results

以花青素提取量（mg/g）為響應值（Y），使用軟件Design Expert 8.0進行多元回歸擬合，獲得二次回歸方程：Y=4.28-0.071A-0.031B+0.27C-0.070AB-0.002 5AC+0.007 5BC-0.35A2-0.32B2-0.64C2。

2.3 模型顯著性檢驗

模型顯著性檢驗見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

從表3的模型方差分析中可以看出，本試驗的二次多項模型極顯著性（P＜0.01），失擬項不顯著（P=0.050 3＞0.01），說明該模型對胭脂蘿卜花青素提取量進行分析與預測是可靠的。模型的一次項A、C的影響極顯著，B的影響不顯著，單因素對胭脂蘿卜提取量影響的順序為C>A>B，即酶解pH值＞復合酶用量＞酶解時間。二次項中酶解pH值、復合酶用量、酶解時間的影響均極顯著。交互項中酶解時間和復合酶用量的影響顯著、復合酶用量和酶解pH值的影響不顯著，酶解pH值和酶解時間影響不顯著。進一步縮減模型，得到Y(jié)=4.28-0.071A+0.27C-0.070AB-0.35A2-0.32B2-0.64C2。

復合酶用量、酶解時間和酶解pH值之間的交互作用對花青素提取量的影響見圖6。通過Design-Expert軟件進行分析胭脂蘿卜花青素最佳提取工藝，得到回歸方程的最大值點是：果膠酶∶纖維素酶（質(zhì)量比）1∶2、酶解溫度 50℃、酶解 pH4.21、復合酶用量 0.03mg/g、酶解時間95.73 min，考慮到實際操作性將工藝參數(shù)修正為：果膠酶∶纖維素酶（質(zhì)量比）1∶2、酶解溫度50℃、酶解pH 4.0、復合酶用量0.03 mg/g、酶解時間95 min，花青素提取量的預測值最高為4.31mg/g。在此條件下進行5次試驗，花青素提取量為4.25mg/g，相差0.06mg/g，說明該優(yōu)化工藝所得試驗結(jié)果穩(wěn)定；與預測值的相對誤差為1.39%，說明采用響應面優(yōu)化法獲得的提取條件是可靠的。

圖6 響應面分析Fig.6 Response surface analysis

2.4 胭脂蘿卜花青素抑菌性

2.4.1 胭脂蘿卜花青素對供試菌的抑制率

胭脂蘿卜花青素對供試菌的抑制率見圖7。

由圖7可知，胭脂蘿卜花青素對枯草芽孢桿菌的抑菌率最高，為92.09%；對大腸桿菌和白色念珠菌的抑制率分別為77.22%和75.16%；對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制率分別為71.32%和67.58%；對黑曲霉的抑菌率最低，為39.61%?？梢猿醪脚袛嚯僦}卜花青素對菌種的抑菌效果為：枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌＞白色念珠菌＞金黃色葡萄球菌＞鼠傷寒沙門氏菌＞黑曲霉。

抑菌圈試驗結(jié)果見表4。

圖7 胭脂蘿卜花青素的抑菌率Fig.7 Bacteriostasis rate of carmine radish anthocyanins

表4 抑菌圈的測定Table 4 Bacteriostatic ring determination

表5 胭脂蘿卜花青素的最小抑菌濃度Table 5 Minimum inhibitory concentration of carmine radish anthocyanin

在相同濃度下，胭脂蘿卜花青素對供試菌有不同的抑菌活性。其中，胭脂蘿卜花青素對枯草芽孢桿菌的抑制效果最好，抑菌圈達到18.1 mm；對大腸桿菌和白色念珠菌的抑菌圈分別為17.1 mm和16.0 mm；對金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌圈分別為15.2 mm和12.7 mm；對黑曲霉沒有顯著抑菌效果。抑菌圈與抑菌率的結(jié)果一致。由此可得出胭脂蘿卜花青素對供試菌的抑制效果為：枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌＞白色念珠菌＞金黃色葡萄球菌＞鼠傷寒沙門氏菌＞黑曲霉。

2.4.2 胭脂蘿卜花青素的最小抑菌濃度（MIC）

胭脂蘿卜花青素的最小抑菌濃度見表5。

由表5可見，隨著胭脂蘿卜花青素的濃度增加，抑菌效果增強。其對枯草芽孢桿菌抑菌性最高，最低抑菌濃度為0.8%；對大腸桿菌、白色念珠菌的的抑菌效果較強，最低抑菌濃度為1.2%；對金黃色葡萄球菌的抑菌性較弱，其最低抑菌濃度為1.6%；對鼠傷寒沙門氏菌和黑曲霉的最低抑菌濃度分別為2.0%、2.4%。

3 結(jié)論

本研究采用Box.Behnken的中心組合設計及響應面分析，建立了酶法提取胭脂蘿卜花青素提取的二次多項式數(shù)學模型。經(jīng)檢驗證明該模型是合理可靠的，能夠優(yōu)化胭脂蘿卜花青素的提取量的工藝。酶法提取胭脂蘿卜花青素最佳工藝參數(shù)為果膠酶：纖維素酶（質(zhì)量比）1：2、酶解溫度 50℃、酶解 pH 4.0、復合酶用量0.03 mg/g、酶解時間95 min，花青素的最大提取量為4.25 mg/g。

進一步研究胭脂蘿卜花青素的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，胭脂蘿卜花青素對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌抑制效果較好，對金黃色葡萄球菌有一定抑制效果，對鼠傷寒沙門氏菌和黑曲霉無抑制。張俊等[15-16]對紫胡蘿卜花青素的抗菌活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著花青素濃度的增加，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果隨之增加，并且對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果較大，對糞鏈球菌的抑菌效果較差。當花青素粗提取液濃度達到5 mg/mL時，紫甘薯花青素對大腸桿菌的抑菌率為100%，對革蘭氏陰性細菌的抑菌性大于霉菌[8，17]。而在本次試驗中，胭脂蘿卜花青素濃度為5 mg/mL時，對枯草芽孢桿菌的抑菌率最高達到92.09%，對大腸桿菌的抑菌率為77.22%，與其它報道結(jié)果基本相符。

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Enzymatic Extraction and Antibacterial Activity of Anthocyanin from Carmine Radish

LIANG Shan，XU Bo，LIU Huan，CAO Yan，JIANG Zi-chuan
（Life Science&Technology College，Yangtze Normal University，Chongqing 408100，China）

To explore the technology of extraction anthocyanin from carmine radish，five single factors were studied including cellulase-pectinase ratio，enzyme dosage，enzymolysis time，enzymolysis temperature and pH.The optimum extraction technology was determined based on center combination design and response surface analyze.The cellulase-pectinase ratio was 1∶2（quality ratio），enzyme dosage was 0.03 mg/g for 95 min at 50℃with pH4.0.Under this condition，anthocyanin extraction content was 4.25 mg/g.In addition，spectrophotometric and oxford cup method were used to conduct bacteriostasis experiment.The results indicated，the anthocyanin from carmine radish had antibacterial activity against bacteria，the minimal inhibitory concentration for Bacillus subtilis，Escherichia coli，Candida albicans were 0.8%，1.6%and 1.6%.

carmine radish；anthocyanin；enzymatic extraction；antibacterial activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.011

2017-04-26

重慶市教委科研基金（KJ1601207）；長江師范學院校級項目（2015XJXM04）

梁姍（1982—），女（漢），講師，博士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物活性。