劉威，閔偉紅，*，劉春雷，曹柏營，趙凡睿

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春130118）

核桃清蛋白抗氧化肽的制備及其活性研究

劉威1，2，閔偉紅1，2，*，劉春雷1，2，曹柏營1，2，趙凡睿1，2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春130118）

以核桃清蛋白為原料，用堿性蛋白酶進行酶解制備抗氧化肽，通過單因素與響應(yīng)面試驗，分析確定制備核桃清蛋白抗氧化肽的最佳工藝條件為：pH9.5，溫度45℃，底物濃度4%，加酶量8 000 U/g，酶解時間2.5 h。對最優(yōu)條件下制備的抗氧化肽進行活性研究，測定其Fe2+螯合能力及對羥基自由基、DPPH·、ABTS+·3種自由基的清除能力，結(jié)果表明核桃清蛋白抗氧化肽對幾種自由基均有顯著的清除作用和金屬離子螯合能力，是一種活性的的天然抗氧化劑。

核桃清蛋白；酶解優(yōu)化；抗氧化活性

研究表明，許多疾病可稱為“自由基”疾病，能否有效地清除自由基成為解決各類疾病的關(guān)鍵問題。近年來藥食同源植物受到廣泛的重視，開發(fā)植物資源的功能活性提取成分及保健食品具有巨大潛力及應(yīng)用價值，且開發(fā)具有抗氧化活性的植物提取物用以預防和治療氧化及自由基引發(fā)的疾病，減少心腦血管疾病、腫瘤及機體老化引發(fā)的各類疾病的發(fā)病率具有重要的意義[1-2]。

長白山核桃仁蛋白含量一般為14%～17%，最高可達29.7%，消化率可達85%以上[3-4]，核桃蛋白效價與動物蛋白相近，是一種良好的植物蛋白質(zhì)。其中清蛋白占核桃蛋白的40%左右，是一種水溶性蛋白。本研究采用響應(yīng)面分析法對酶解制備核桃清蛋白抗氧化肽進行工藝優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上研究其抗氧化活性，為核桃蛋白的充分利用和核桃多肽功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。與人工合成的抗氧化劑相比，通過酶解植物蛋白得到的抗氧化肽更受到人們的青睞[5-7]，它們具有易于被人體吸收、安全無副作用的特點，所以植物抗氧化肽的開發(fā)和應(yīng)用前景十分廣闊[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃清蛋白：吉林農(nóng)業(yè)大學發(fā)酵工程實驗室自制（參照Tan的方法[9]）。

DPPH、ABTS、菲洛嗪：sigma公司；堿性蛋白酶2.4 L（酶活力45 642 U/mL）：諾維信生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

1.2 方法

1.2.1 核桃清蛋白抗氧化肽的制備

核桃清蛋白溶液進行均質(zhì)，90℃水浴鍋內(nèi)水浴15 min，冷卻至酶解溫度，用NaOH（0.5 mol/mL）調(diào)節(jié)蛋白溶液到一定pH值，加入定量堿性蛋白酶，酶解一定時間（此過程用NaOH調(diào)節(jié)pH值），酶解結(jié)束后，在90℃水浴鍋內(nèi)水浴15 min進行滅酶處理，用NaOH調(diào)節(jié)蛋白溶液到pH值至7，5 000 r/min離心10 min，取上清，冷凍干燥后得到核桃清蛋白抗氧化肽。

1.2.2 水解度（DH）測定

水解度的測定采用pH-stat法[10]

1.2.3 單因素試驗設(shè)計

以酶解物的羥基自由基清除能力為指標。底物濃度 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 g/mL，溫度 40、45、50、55、60 ℃，加酶量 2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g（以干基計），pH 值 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5， 酶 解 時 間 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 h，進行單因素試驗。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化核桃清蛋白抗氧化肽酶解制備工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選出影響較大的3個因素，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，開展三因素三水平的響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理均利用Design Expert 8.0.5軟件完成，試驗因素及水平表見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Factors and their coded levels teasted in response surface analysis

1.2.5 核桃清蛋白抗氧化肽抗氧化性的測定

1.2.5.1 羥基自由基（·OH）清除作用的測定

參照Amarowicz的試驗方法[11]。

沒有什么值得敬服之處的蘇州園林，毫無“月落烏啼”詩意的寒山寺，這些現(xiàn)實擊碎了芥川腦海里由古詩詞所構(gòu)建的浪漫唯美的中國形象，作為“中國趣味的愛好者”，當他來到中國，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)實中的中國與古詩詞中的中國之間的反差時，失望之情溢于言表。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除作用的測定

參照Kong的試驗方法[12]。

1.2.5.3 DPPH自由基清除能力測定

參照Xie的試驗方法[13]。

1.2.5.4 Fe2+螯合能力的測定

參照Yu-Ling Lee的試驗方法[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

對酶解時間、pH值、加酶量、底物濃度、水解溫度進行了單因素試驗，見圖1～圖5。

圖1 酶解時間對羥基自由基清除能力和水解度的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on scavenging capacities against hydroxyl radical and DH

圖2 pH值對羥基自由基清除能力和水解度的影響Fig.2 Effect of pH on scavengin capacities against hydroxyl radical and DH

根據(jù)圖1～圖5所示，當羥基自由基清除能力和水解度兩種指標上升及下降趨勢一致時，單因素，結(jié)果比較容易確定，當兩種指標趨勢不一致時，綜合考慮兩種指標，由于試驗重點是測定蛋白及其水解多肽的抗氧化性質(zhì)，所以測定考慮其對羥基自由清除能力這一指標的考察，可以得到時間2.5 h、pH9.0、加酶量為8 000 U/g、底物濃度3%、水解溫度50℃為最佳水解條件，選取其中影響較大的水解溫度、pH值、底物濃度三因素進行響應(yīng)面設(shè)計。

圖4 底物濃度對羥基自由基清除能力和水解度的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on scavenging ca-pacities against hydroxyl radical and DH

圖5 酶解溫度對羥基自由基清除能力和水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on reducing power and DH

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化核桃清蛋白酶解工藝

2.2.1 模型的建立與分析

響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果見表2。

以羥基自由基清除能力為響應(yīng)值進行了回歸模擬方差分析，結(jié)果見表3。以下為以羥基自由基清除能力為響應(yīng)值回歸擬合所得各因素函數(shù)表達：

羥基自由基清除能力（%）=-717.83+87.445A+10.301 5B+75.452 5C-1.474AB-1.8AC-0.305BC-0.39A2+0.038 3B2-5.477 5C2

由方差分析得出P值，模型極顯著，模型的失擬性不顯著，回歸決定系數(shù)R2=0.942 9，修正決定系數(shù)，說明方程擬合性較好，可以應(yīng)用于對酶解條件的分析預測。根據(jù)結(jié)果進行分析：一次項C極顯著，二次項C2極顯著。說明該模型擬合程度較好，用該模型對酶解制備核桃抗氧化肽的工藝進行優(yōu)化是合適的，得到最優(yōu)的酶解工藝條件為：pH9.5，溫度45℃，底物濃度4%，加酶量8 000 U/g，酶解時間2.5 h。

表2 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results for response surface analysis

表3 回歸模擬方差分析Table 3 Regression and the analysis of variance

2.2.2 驗證試驗

在最優(yōu)條件下對響應(yīng)面優(yōu)化條件進行驗證，羥基自由基清除能力77.03%，接近預測值（79.56%）。與理論值無顯著性差異（P>0.05），表明試驗所得模型具有實際價值。

2.3 核桃清蛋白抗氧化肽抗氧化性的測定

2.3.1 ABTS+自由基清除能力的測定

ABTS在適當?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+自由基，有自由基清除劑存在時，ABTS+·的產(chǎn)生會被抑制，測定吸光度即可得出樣品清除ABTS+自由基的能力見圖6。

圖6 清蛋白抗氧化肽、VC對ABTS+自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of albumin antioxidant peptide and VCwith ABTS+radical

如圖6所示，清蛋白抗氧化肽對ABTS+自由基的清除率隨濃度的增大不斷升高，當濃度為0.5 mg/mL時，清除效果達到（74.37±1.5）%，對ABTS+自由基的清除能力高于松子抗氧化肽（60%，1 mg/mL）、經(jīng)胰液素酶水解脫脂核桃粉蛋白質(zhì)得到的水解物[（69.21±7.66）%，0.5 mg/mL][15-16]。

2.3.2 DPPH自由基清除能的測定

試驗中以VC為陽性對照，測定不同濃度時VC及多肽對DPPH自由基的清除作用見圖7。

圖7 清蛋白抗氧化肽、VC對DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of albumin antioxidant peptide and VCwith DPPH radical

如圖7所示，清蛋白抗氧化肽對DPPH自由基的清除率隨濃度的增大而升高，表現(xiàn)出良好的劑量關(guān)系，并在0.5 mg/mL時達到（92.63±1.83）%，高于經(jīng)胰液素酶水解脫脂核桃粉蛋白質(zhì)得到的水解物[（87.79±1.49）%，2.0 mg/mL]、谷胱甘肽[（94.83±0.35）%，2.0 mg/mL]、核桃分離蛋白酶解產(chǎn)物（90.08%，1.2 mg/mL）[16-17]。

2.3.3 羥基自由基（·OH）清除作用的測定

羥基自由基是人體內(nèi)危害性最大的自由基。在反應(yīng)過程中，亞鐵離子與雙氧水釋放出的羥基自由基會與水楊酸結(jié)合，形成紫色物質(zhì)。有自由基清除劑存在時，紫色會褪去，從褪色程度可以判斷其清除自由基能力的強弱見圖8。

圖8 清蛋白抗氧化肽、VC對羥基自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of albumin antioxidant peptide and VCwith hydroxyl radical

如圖8所示，清蛋白抗氧化肽對羥基自由基的清除作用隨濃度的增加而顯著提高，當濃度為5 mg/mL時，清除率到達84.07%，高于核桃分離蛋白酶解產(chǎn)物（94.56%，15 mg/mL）、松子抗氧化肽（32.15%，8 mg/mL）[17，15]。

2.3.4 Fe2+螯合能力的測定

亞鐵離子的存在，會加速脂質(zhì)氧化的過程，所以測定對金屬離子的螯合能力可以衡量出樣品的抗氧化能力見圖9。

圖9 清蛋白氧化肽、EDTA對Fe2+的螯合能力作用Fig.9 Ferrous ions chelating capacity of albumin antioxidant peptide and EDTA

如圖9所示，清蛋白抗氧化肽對Fe2+的螯合能力呈現(xiàn)良好的劑量關(guān)系，濃度僅為0.5 mg/mL時螯合率為89.65%，高于經(jīng)胰液素酶水解脫脂核桃粉蛋白質(zhì)得到的水解物[74.00±2.03%，2.0（mg/mL）][16]。

3 結(jié)論

本試驗以核桃清蛋白為原料，用堿性蛋白酶進行酶解，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解制備抗氧化肽的最佳工藝條件為：pH9.5，溫度45℃，底物濃度4%，加酶量8 000 U/g，酶解時間2.5 h，此條件下水解度為28.68%，羥基自由基清除能力73.34%。

試驗考察了酶解制備的清蛋白抗氧化肽的活性，濃度為5 mg/mL時，羥基自由基清除率達到84.07%，濃度為0.5 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到（92.63±1.83）%、ABTS+自由基清除率達到（74.37±1.5）%、Fe2+螯合率達到89.65%。結(jié)果表明，核桃清蛋白抗氧化肽的抗氧化能力在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的劑量關(guān)系。根據(jù)其劑量關(guān)系趨勢，我們可以斷定，在濃度足夠大時，核桃清蛋白抗氧化肽對羥基自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基的清除率及Fe2+螯合率均能夠達到100%。而且通過與其他原料的蛋白、多肽在不同抗氧化指標的比較可以知道，清蛋白抗氧化肽的抗氧化指標效果是非常好的。所以核桃清蛋白抗氧化肽具有較強的抗氧化活性，對幾種自由基均有顯著的清除作用，是一種良好的天然抗氧化劑，擁有廣闊的研究價值和市場前景。

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Preparation and Activity of Antioxidant Peptide from Walnut Albumin

LIU Wei1，2，MIN Wei-hong1，2，*，LIU Chun-lei1，2，CAO Bai-ying1，2，ZHAO Fan-rui1，2
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；
2.National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing，Changchun 130118，Jilin，China）

Walnut albumin were used as raw material，walnut albumin isolated was hydrolyzed by Alcalase to prepare antioxidant peptide.Through single-factor experiment and response surface method，the optimal hydrolysis conditions were determined as pH of 9.5，temperature of 45℃，substrate concentration of 4%，Alcalase concentration of 8 000 U/g and hydrolysis time of 2.5 h.To assess the antioxidant potential，walnut albumin antioxidant peptide was tested for its ferrous ions chelating capacity and scavenging capacities against hydroxyl radical，DPPH·，ABTS+·.The experimental results showed that walnut albumin antioxidant peptide had significant scavenging effect against several kinds of free radicals，and ferrous ions chelating capacity，and it was a kind of natural antioxidants which had stronger antioxidant activities.

walnut albumin；hydrolysis optimization；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.010

2016-12-15

國家“863”計劃項目（2013AA102206）

劉威（1991—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物化學與功能性食品。

*通信作者：閔偉紅（1971—），女，教授，博士生導師，主要從事發(fā)酵工程、糧油科學與深加工技術(shù)研究。