鐵梅，劉麗，莊曉虹，姚懿，孫繼鳳，吳鈺瀅，李華為，*

（1.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110036；2.沈陽(yáng)師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110034）

硒蛋白和過氧化氫酶清除羥自由基作用的研究

鐵梅1，劉麗1，莊曉虹1，姚懿1，孫繼鳳1，吳鈺瀅2，李華為2，*

（1.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110036；2.沈陽(yáng)師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110034）

在甲基紫-Fe2+-H2O2體系中，試驗(yàn)得到最佳測(cè)定條件：緩沖溶液用量為1.0 mL、甲基紫用量為3.5 mL、Fe2+用量為3.0 mL和H2O2加樣量為2.5 mL。采用紫外可見分光光度法研究富硒食用菌中硒蛋白和過氧化氫酶對(duì)羥自由基的清除作用。結(jié)果表明：硒蛋白清除羥自由基的能力明顯高于相同濃度的無機(jī)硒和蛋白質(zhì)，且清除率隨著各自加入量的增加而相應(yīng)增加；硒蛋白和過氧化氫酶對(duì)清除羥自由基具有一定的協(xié)同作用，為富硒食品的合理開發(fā)和利用提供了一定的參考依據(jù)。

硒蛋白；過氧化氫酶；羥自由基

活性氧自由基具有活潑的化學(xué)性質(zhì)，是人體生命活動(dòng)中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，在需氧生物體內(nèi)保持自由基穩(wěn)橫性動(dòng)態(tài)的特征[1-2]。當(dāng)體內(nèi)清除氧自由基的酶減少或機(jī)體受到外界刺激生成過量自由基打破其平衡時(shí)，對(duì)人體內(nèi)生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)等造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞?；钚匝踝杂苫饕ǔ蹶庪x子和羥自由基等。羥自由基（·OH）是目前為止被認(rèn)為毒性最強(qiáng)，最活躍的活性分子，幾乎可以與所有的生物分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，比如羥自由基可以引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，具有損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能和多種生物分子的能力，引發(fā)腫瘤、心血管、肺氣腫等疾病[3-5]。使用抗氧化劑能夠有效清除自由基，并且對(duì)于自由基引起的疾病有預(yù)防和治療的作用。而內(nèi)源性抗氧化劑難以抵抗自由基引起的病變，所以外源性抗氧化劑和具有抗氧化功能的食品便成為近年來的研究熱點(diǎn)[6-8]。

硒是人體必需的微量元素，食品中硒可分為無機(jī)硒和有機(jī)硒，無機(jī)硒毒性大，而硒與蛋白、多糖和核酸結(jié)合，形成的硒蛋白、硒多糖等有機(jī)硒生物大分子化合物，其無毒、安全、生物利用率高[9-10]。硒蛋白具有一定的抗氧化作用，具有清除體內(nèi)自由基及抗衰老作用，對(duì)人體健康有著極為重要的意義[11-12]。過氧化氫酶存在于紅細(xì)胞及某些組織內(nèi)的過氧化體中，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[13]，它的主要作用就是催化H2O2分解為H2O與O2，使得H2O2不會(huì)與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的·OH。目前對(duì)于富硒食用菌硒蛋白和過氧化氫酶體系的抗氧化性研究較少，本文提取富硒金針菇和蛹蟲草中的硒蛋白，利用甲基紫-Fe2+-H2O2體系研究其對(duì)羥自由基的清除作用，進(jìn)一步探討硒蛋白與過氧化氫酶清除羥自由基的作用，對(duì)開發(fā)天然有機(jī)硒補(bǔ)劑、研發(fā)抗氧化藥物、預(yù)防疾病具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7500c型ICP-MS：美國(guó)Agilent公司；Cary 50紫外-可見分光光度計(jì)：美國(guó)VARIAN公司；冷凍離心機(jī)：美國(guó)科峻電器公司；HZQ-Q全溫震蕩器：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

考馬斯亮藍(lán)G250（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨（分析純）：沈陽(yáng)力誠(chéng)試劑廠；甲基紫（分析純）：沈陽(yáng)市試劑三廠；雙氧水（分析純）：沈陽(yáng)力誠(chéng)試劑廠；硫酸亞鐵（分析純）：沈陽(yáng)新興試劑廠；鹽酸（優(yōu)級(jí)純）：北京化工廠；過氧化氫酶（10000U/mg）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 富硒食用菌硒蛋白的制備

稱取富硒食用菌干樣1.0 g，加20 mL，pH值為3.5的Tris-HCl溶液，全溫震蕩器內(nèi)浸提2.0 h，抽濾。重復(fù)一次，合并濾液，并向其中加入硫酸銨至飽和度為95%，透析后，分別以考馬斯亮藍(lán)染色法[14]和ICP-MS法[15]測(cè)定蛋白濃度C蛋白和硒的含量C硒，剩余置-20℃下儲(chǔ)藏備用。

1.2.2 羥自由基的測(cè)定

H2O2和Fe2+發(fā)生Fenton產(chǎn)生·OH。甲基紫在pH≥3的酸性溶液中呈紫色，·OH容易進(jìn)攻高電子云密度點(diǎn)，會(huì)與甲基紫中具有高電子云密的—C=C—基團(tuán)發(fā)生親電加成反應(yīng)，從而使甲基紫褪色。通過測(cè)定甲基紫吸光度值的變化可測(cè)定出·OH的生成量。

在10 mL比色管中依次加入2×10-4mol/L甲基紫溶液 1.5、2.5、3.5、4.5 mL，0.1 mol/L pH=3.5 的 Tris-HCl溶液 0.5、0.75、1、1.25 mL，1×10-3mol/L 的 Fe2+溶液 2、2.5、3、3.5 mL，0.12% 的 H2O2溶液 1.5、2、2.5、3 mL 分別做單因素試驗(yàn)，定容10.0mL，搖勻，放置30 min，在波長(zhǎng)578 nm處測(cè)定吸光度A對(duì)照；將Fe2+溶液和H2O2以H2O代替做空白A空白，則△A0=A對(duì)照-A空白，根據(jù)朗伯比爾定律可以求得羥自由基的生成量。

1.2.3 富硒食用菌硒蛋白清除羥自由基的研究

在1.2.2體系中，分別加入1.0、3.0、5.0 mL富硒食用菌中提取的硒蛋白清除羥自由基，搖勻后加入H2O2，30 min后在波長(zhǎng)578 nm處測(cè)定吸光度A樣品，計(jì)算其與空白的△A1=A樣品-A空白，則硒蛋白對(duì)自由基的清除率S按以下公式計(jì)算：

1.2.4 富硒食用菌硒蛋白與過氧化氫酶的協(xié)同作用研究

在1.2.2體系中，加入3 mL硒蛋白和3 mL不同濃度的過氧化氫酶，搖勻后再加H2O2，30 min后測(cè)定吸光度。按上式計(jì)算清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 生成羥自由基的試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 吸收光譜

分別測(cè)定了甲基紫溶液（MV）、MV-Fe2+溶液、MV-H2O2溶液和MV-Fe2+-H2O2溶液的吸收光譜，結(jié)果見圖1。

圖1 吸收光譜Fig.1 Absorption spectra

發(fā)現(xiàn)前三者的最大吸收波長(zhǎng)均在582 nm附近且吸光度值幾乎不變，而MV-Fe2+-H2O2溶液的最大吸收波長(zhǎng)值移到578 nm，并且吸光度明顯降低，說明體系吸光度值的下降是Fenton試劑產(chǎn)生的羥自由基使酸性溶液中甲基紫褪色造成的，并確定紫外-可見分光光度計(jì)的測(cè)定波長(zhǎng)為578 nm。

2.1.2 緩沖液對(duì)△A的影響

分別考察了緩沖液pH值和用量對(duì)△A0的影響，見圖2和圖3。

由圖2可知，隨著pH值的增加，體系中的△A0先增大后減小，所以選取pH=3.5，此時(shí)羥自由基含量最大。圖3中△A0隨著緩沖液用量的增加在降低，但在0.75 mL和1.50 mL之間變化非常緩慢。故本試驗(yàn)選用緩沖溶液體積為1.0 mL。

圖2 緩沖溶液pH值對(duì)△A的影響Fig.2 Effect of pH on the absorption

圖3 緩沖溶液用量對(duì)△A的影響Fig.3 Effect of dosage of buffer solution on the absorption

2.1.3 甲基紫用量的影響

緩沖溶液pH值為3.5，用量為1.0 mL，加入不同體積的甲基紫溶液，甲基紫用量對(duì)△A的影響見圖4。

圖4 甲基紫用量對(duì)△A的影響Fig.4 Effect of dosage of methyl violet on the absorption

從圖4中發(fā)現(xiàn)隨著甲基紫用量的增加，△A0也在增加。當(dāng)甲基紫溶液體積為3.5 mL時(shí)，△A0趨于穩(wěn)定。所以本試驗(yàn)甲基紫用量為3.5 mL。

2.1.4 Fe2+用量和H2O2用量的影響

在緩沖溶液pH值為3.5，用量為1.0 mL，甲基紫用量為3.5 mL的條件下，考查Fe2+和H2O2用量對(duì)△A0的影響，見圖5和圖6。

由圖5可見隨著Fe2+溶液的增加而增加，當(dāng)Fe2+用量為3.0 mL時(shí)，△A0趨于穩(wěn)定，故本試驗(yàn)Fe2+用量為3.0 mL。而在圖6中可以看出隨著H2O2用量的增加，在2.5 mL時(shí)△A0出現(xiàn)最大值，所以H2O2的加樣量為2.5 mL。

圖5 Fe2+用量對(duì)△A的影響Fig.5 Effect of dosage of Fe2+on the absorption

圖6 H2O2用量對(duì)△A的影響Fig.6 Effect of dosage of H2O2on the absorption

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間的影響

在緩沖溶液pH=3.5，用量為1.0 mL，甲基紫、Fe2+和H2O2的用量分別為3.5、3.0和2.5 mL時(shí)，每5分鐘取樣測(cè)定一次吸光度。反應(yīng)時(shí)間對(duì)△A的影響見圖7。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)△A的影響Fig.7 Effect of reaction time on the absorption

從圖7中可以看出隨反應(yīng)時(shí)間的增加，△A0逐漸升高，反應(yīng)進(jìn)行到30 min時(shí)，△A0趨于穩(wěn)定。所以反應(yīng)時(shí)間定為30 min。

2.2 富硒食用菌硒蛋白清除羥自由基的作用

2.2.1 硒蛋白清除羥自由基作用

經(jīng)ICP-MS法和考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，蟲草硒蛋白C硒為 19.352 3 μg/L、C蛋白為 126.17 μg/mL ，金針菇硒蛋白中硒的濃度為19.574 8 μg/L、蛋白質(zhì)濃度為95.83 μg/mL。按照產(chǎn)生羥自由基工作原理設(shè)計(jì)的反應(yīng)體系，分別加入硒蛋白、蛋白質(zhì)和亞硒酸鈉溶液，使得蛋白質(zhì)的濃度和硒的濃度分別與硒蛋白中的蛋白質(zhì)和硒濃度在同一水平，在體系中依次加入1、3、5 mL的硒蛋白，從而分為由低到高3種不同的濃度組，在波長(zhǎng)578 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式計(jì)算清除率見圖8和圖9。

圖8 富硒蟲草硒蛋白對(duì)羥自由基的清除率Fig.8 The scavenging effect of selenoprotein of Se-enriched Cordyceps militaris to hydroxyl free radical

圖9 富硒金針菇硒蛋白對(duì)羥自由基的清除率Fig.9 The scavenging effect of selenoprotein of Se-enriched Flammulina velutipes to hydroxly free radical

從圖8、9可以看出：不同濃度的亞硒酸鈉，蛋白質(zhì)和硒蛋白對(duì)羥自由基均有清除作用，且清除率隨著各自加入量的增加而增加。無論是低濃度組還是高濃度組，富硒食用菌蛋白對(duì)羥自由基的清除率均顯著地高于普通蛋白質(zhì)以及亞硒酸鈉，因?yàn)楦晃秤镁鞍缀推鋵?duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度相同，富硒食用菌中所含的硒又與亞硒酸鈉溶液中硒的濃度相同，因此這一結(jié)果說明，硒增強(qiáng)了食用菌蛋白清除羥自由基的能力，富硒食用菌中硒蛋白具有更高的抗氧化作用。在各濃度組中，蛋白質(zhì)和亞硒酸鈉對(duì)·OH的清除率之和小于富硒食用菌蛋白對(duì)·OH的清除率，且存在極顯著差異，說明硒與食用菌蛋白質(zhì)之間在清除自由基方面存在協(xié)同作用。

2.2.2 富硒食用菌硒蛋白與過氧化氫酶（CAT）的協(xié)同清除羥自由基作用

硒蛋白與過氧化氫酶分別對(duì)·OH具有清除作用，而本研究在此基礎(chǔ)上向體系中共同添加兩種物質(zhì)，即按照產(chǎn)生羥自由基工作原理設(shè)計(jì)的反應(yīng)體系，在加入H2O2之前，加入3 mL硒蛋白后，加入不同濃度的過氧化氫酶經(jīng)過紫外可見光譜測(cè)定，根據(jù)公式計(jì)算清除率見圖10。

圖10 CAT與硒蛋白對(duì)羥自由基的清除率Fig.10 The scavenging effect of CAT and selenoprotein to hydroxly radical

從圖10可知，過氧化氫酶對(duì)羥自由基的清除率在0～200 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，S=0.193 4C+11.47，R2=0.997 8。與單獨(dú)過氧化氫酶相比，加入富硒食用菌蛋白后，對(duì)羥自由基的清除率顯著增強(qiáng)，并且在相同過氧化氫酶濃度下，·OH清除率要大于單一的過氧化氫酶和硒蛋白的清除率之和，說明富硒食用菌蛋白和過氧化氫酶在清除羥自由基方面存在著協(xié)同作用。

3 結(jié)論

鑒于羥自由基的毒害性，使得人們對(duì)抗氧化劑的研究越來越多。以食用菌為載體進(jìn)行富硒培養(yǎng)得到富硒食用菌，不僅具有食用菌的效果，還增加了新的功效。研究結(jié)果表明：1）生成羥自由基的最佳試驗(yàn)條件：在甲基紫-Fe2+-H2O2體系中，緩沖溶液用量為1.0 mL、甲基紫用量為3.5 mL、Fe2+用量為3.0 mL和H2O2的加樣量為2.5 mL。2）硒蛋白對(duì)羥自由基的清除率高于同質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)和亞硒酸鈉，表明硒增強(qiáng)食用菌蛋白消除羥自由基的能力，且隨著加入量的增加，硒蛋白、蛋白質(zhì)和亞硒酸鈉對(duì)羥自由基的清除率均增強(qiáng)。3）硒蛋白的加入促進(jìn)過氧化氫酶對(duì)羥自由基的清除作用，兩者在清除羥自由基方面存在著協(xié)同作用。因此，富硒食用菌中的硒蛋白作為一種天然無毒高效的自由基清除劑，能夠拮抗或抑制體內(nèi)過量的自由基，增強(qiáng)體內(nèi)抗自由基酶系統(tǒng)的活力，從而預(yù)防相關(guān)疾病的發(fā)生，維護(hù)人體健康。

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Studies on Scavenging Hydroxyl Free Radical by Selenoprotein and Catalase

TIE Mei1，LIU Li1，ZHUANG Xiao-hong1，YAO Yi1，SUN Ji-feng1，WU Yu-ying2，LI Hua-wei2，*
（1.College of Environmental Sciences，Liaoning University，Shenyang 110036，Liaoning，China；2.College of Chemistry and Life Sciences，Shenyang Normal University，Shenyang 110034，Liaoning，China）

The experimental conditions of Fenton system of MV-Fe2+-H2O2has been studied and the optimal determination conditions were found out with buffer solution 1.0 mL，MV 3.5 mL，F(xiàn)e2+3.0 mL，H2O22.5mL，respectively.In the best condition of Fenton system，the effect of scavenging hydroxyl free radical of selenoprotein and catalase were studied by ultraviolet spectrophotometer.The result indicated that selenoprotein on hydroxyl free radical removal rate were higher than those of commom protein and inorganic selenium at the same concentration，and removal rate increased with addition amount；selenoprotein and catalase in scavenging hydroxyl free radical had synergistic effect.A basis was provided for reasonable exploitation and utilization of selenium enriched food.

selenoprotein；catalase；hydroxyl free radical

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.002

2016-11-08

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371085）；遼寧省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（2011205001）

鐵梅（1964—），女（漢），教授，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品、食品中微量元素的檢測(cè)方法、形態(tài)分析、生物活性及遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律等。

*通信作者：李華為（1962—），男，教授，碩士，研究方向：分析化學(xué)。