范紅英，陳 圓，曾鳳群，李紅偉

（惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007）

不同日齡惠陽(yáng)胡須雞肌肉中IGF1、MyoD基因表達(dá)研究

范紅英，陳 圓，曾鳳群，李紅偉

（惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007）

已有研究表明，IGF1（胰島素樣生長(zhǎng)因子1）、MYOD（肌分化因子）基因在肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化上具有重要的調(diào)控作用.本研究以在惠陽(yáng)胡須雞為研究對(duì)象，采集不同日齡（86、155、213、300、394、454）的惠陽(yáng)胡須雞的胸肌和腿肌，然后通過(guò)提取RNA、反轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、熒光定量PCR分析了這兩個(gè)基因在不同日齡惠陽(yáng)胡須雞的胸肌和腿肌中的表達(dá)情況.半定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MYOD基因只在86日齡的腿肌中表達(dá)，而IGF1基因在不同日齡的胡須雞胸腿肌中均有表達(dá)，而熒光定量PCR的結(jié)果顯示IGF1基因在胸腿肌的相對(duì)表達(dá)量存在差異，但沒(méi)有達(dá)到顯著性.這些結(jié)果為深入了解IGF1基因在雞肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的作用提供了新的證據(jù).

惠陽(yáng)胡須雞；IGF1基因；MyoD基因；熒光定量PCR1

IGF1，全稱為胰島素生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor1，IGF1），其基因定位于雞的1號(hào)染色體.MyoD即肌分化因子，是生肌調(diào)節(jié)因子家族的四成員之一，其基因定位在雞的5號(hào)染色體.研究認(rèn)為，雞出生后生長(zhǎng)發(fā)育與雞的IGF1基因的調(diào)節(jié)潛力相關(guān)，其可以調(diào)節(jié)自身的半衰期和活性，而且在細(xì)胞周期、代謝、生長(zhǎng)、增殖和分化等過(guò)程中起重要的調(diào)控作用［1-2］.在對(duì)生肌調(diào)節(jié)因子家族的相關(guān)研究中表明，MyoD基因在肌肉生長(zhǎng)、發(fā)育、再生和退化等過(guò)程具有重要作用.肌原細(xì)胞的分化能力與MyoD基因的表達(dá)水平相關(guān)［3-6］.但這兩個(gè)基因在雞肌纖維后期生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的表達(dá)情況未見報(bào)道.

本研究以IGF1、MyoD基因作為雞的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的候選基因進(jìn)行研究，檢測(cè)后期6個(gè)不同日齡惠陽(yáng)胡須雞胸腿肌中IGF1、MyoD基因的表達(dá)水平，分析IGF1、MyoD基因的表達(dá)與雞不同發(fā)育階段的關(guān)系，為深入了解雞肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律提供新的證據(jù)［7-9］.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)雞群

實(shí)驗(yàn)雞群來(lái)自廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司，選取6個(gè)不同日齡（86天，155天，213天，300天，393天，454天）的惠陽(yáng)胡須雞雞胸、腿肉為試驗(yàn)材料，取樣后迅速放入液氮保存.

1.2 引物設(shè)計(jì)

DNA引物采用的是李娟［10］雞生長(zhǎng)發(fā)育和肌纖維生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)研究所設(shè)計(jì)的引物，MyoD目的基因片段大小為113bp，IFG1目的基因的片段大小為111bp.引物序列如表1.引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.

表1 引物序列

1.3 PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系的總體積是25μL，其中的組分如下：

根據(jù)引物來(lái)源文獻(xiàn)進(jìn)行多次PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定PCR最佳反應(yīng)條件為：預(yù)變性，5分鐘；變性，94℃，30秒；退火，60℃，30秒；延伸，72℃，30秒；循環(huán)數(shù)40，最后72℃延伸5分鐘.

1.4 熒光定量PCR

熒光定量采用7000 System SDS Software，程序設(shè)定如圖1所示.

利用Trizol抽提法提取的RNA，反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)行基因表達(dá)分析.熒光定量采用7000 System SDS Software，設(shè)定收集退火溫度時(shí)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)變化，記錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)中的每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化.反應(yīng)程序每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，將2ul的cDNA溶液換成2ul denuclease-free H2O設(shè)定空白管為陰性對(duì)照.

圖1 熒光定量PCR流程圖

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用相對(duì)定量分析法2-ΔΔct分析，根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)合以下的公式計(jì)算出各待測(cè)基因與對(duì)照組的基因表達(dá)水平倍比F［11］.2-（ΔΔct）表示的是待測(cè)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組數(shù)的變化倍數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 提取RNA的結(jié)果

提取RNA用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)，凝膠成像結(jié)果如下（見圖2）.從圖中看出，凝膠孔內(nèi)基本可見RNA條帶，無(wú)拖帶，顏色明亮清晰，說(shuō)明RNA提取的效果較理想，可用于實(shí)驗(yàn)下一步的反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增.

圖2 RNA提取結(jié)果

2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)果

反轉(zhuǎn)錄后，PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，內(nèi)參基因b-actin的PCR擴(kuò)增效果如圖3所示.如圖4所示，目的基因MyoD片段長(zhǎng)度是113，與Marker比對(duì)是吻合的.目的基因IGF1（13～24）片段長(zhǎng)度是111bp，與Marker比對(duì)也是吻合的，條帶較清晰，表明擴(kuò)增片段與目的基因片段大小一致.1、2，3、4，5、6，7、8，9、10，11、12分別是86日齡胸腿肌、155日齡胸腿肌，213日齡胸腿肌，300日齡胸腿肌，393日齡胸腿肌，454日齡胸腿肌的MyoD基因PCR擴(kuò)增結(jié)果.13、14，15、16，17、18，19、20，21、22，23、24分別是86日齡胸腿肌、155日齡胸腿肌，213日齡胸腿肌，300日齡胸腿肌，393日齡胸腿肌，454日齡胸腿肌的IGF1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果.

圖3 內(nèi)參基因b-actin擴(kuò)增結(jié)果

圖4 MyoD、IGF1基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增結(jié)果

從圖4看出，標(biāo)號(hào)為1～12目的基因MyoD的PCR結(jié)果顯示，MyoD基因只在胡須雞86日齡的腿肌和213日齡的腿肌低水平表達(dá)，在其他的日齡的胸腿肌中沒(méi)有表達(dá).

同樣，標(biāo)號(hào)為13～24目的基因IGF1的PCR結(jié)果表明，IGF1基因在惠陽(yáng)胡須雞的6個(gè)不同日齡中均有表達(dá).因此，我們對(duì)該基因的表達(dá)通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)一步分析研究.

2.3 熒光定量PCR結(jié)果

如圖5所示，IGF1基因在惠陽(yáng)胡須雞86-454天不同日齡的胸肌腿肌間表達(dá)量均無(wú)顯著差異（P＞0.05），IGF1基因在86～393日齡胸肌的相對(duì)表達(dá)量是逐步降低的，IGF1基因在155～300日齡胸肌的相對(duì)表達(dá)量基本相同，393日齡的最低，但是IGF1基因在454日齡的相對(duì)表達(dá)量突然升高，其中原因需進(jìn)一步分析研究.相比IGF1基因在胸肌相對(duì)表達(dá)量的規(guī)律性，在腿肌的相對(duì)表達(dá)量則沒(méi)有表現(xiàn)出規(guī)律，但I(xiàn)GF1基因在300日齡的胸肌腿肌的相對(duì)表達(dá)量都比其他日齡低.

圖5 IGF1基因的相對(duì)表達(dá)量

3.討論

3.1 MyoD基因的表達(dá)

MyoD基因在肌肉生成早期分化過(guò)程中和成肌細(xì)胞增殖階段進(jìn)行表達(dá)［12］，具有決定肌衛(wèi)星細(xì)胞能否成為肌肉干細(xì)胞的功能，在肌肉的發(fā)育過(guò)程具有重要作用［13－15］.Liu［16］等在研究火雞胚胎發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著火雞的胚胎發(fā)育，MyoD基因表達(dá)量呈顯著下降趨勢(shì).王均［17］等研究也表明，MyoD基因的表達(dá)在胚胎發(fā)育第9天已基本達(dá)到峰值，表達(dá)水平在第9-1 3天期間相對(duì)穩(wěn)定，1 3天后表達(dá)水平下降，但在新生時(shí)呈現(xiàn)短暫的反跳增高現(xiàn)象，之后表達(dá)又降至難檢測(cè)水平.這說(shuō)明M y oD基因主要在雞早期的發(fā)育階段表達(dá).本研究中，MyoD基因在86日齡腿肌中有低水平表達(dá)，在其他日齡雞肌肉組織中沒(méi)有表達(dá)，進(jìn)一步證明該基因主要在雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育早期階段表達(dá).

3.2 IGF1基因的表達(dá)

宋衛(wèi)濤［16］等研究結(jié)果表明，IGF-1基因?qū)喤咛テ谕燃〉纳L(zhǎng)發(fā)育具有重要意義.梁耀偉［17］等研究表明，IGF1可能在雞胚胎肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起調(diào)控的作用，同時(shí)它的表達(dá)規(guī)律與成肌細(xì)胞增殖一致，可能參與調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖.李娟等［10］的研究表明，70日齡的二郎山山地雞SD02品系中胸肌IGF1基因表達(dá)量是顯著高于49日齡的.這些研究結(jié)果表明，IGF-1基因不但在雞胚胎肌肉發(fā)育早期有調(diào)控作用，而且參與調(diào)控了成肌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程.本研究結(jié)果表明，IGF1基因在六個(gè)日齡的胸肌、腿肌均有表達(dá)，這表明該基因可能在雞肌肉后期生長(zhǎng)發(fā)育中有著重要作用.

而惠陽(yáng)胡須雞腿肌的IGF1基因表達(dá)量在86日齡到155日齡是呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，從155日齡到300日齡腿肌中IGF1基因的表達(dá)量卻出現(xiàn)明顯的減少，但393日齡和454日齡的胡須雞腿肌中的IGF1基因的表達(dá)都很高，可能是飼養(yǎng)的時(shí)期過(guò)長(zhǎng)，與肌肉的再生與分化有關(guān).因此需要進(jìn)一步研究發(fā)育后期胡須雞肌肉中IGF1基因的作用機(jī)理，全面深入了解IGF1基因?qū)蓐?yáng)胡須雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以便更好地指導(dǎo)育種實(shí)踐.

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【責(zé)任編輯：吳躍新】

Study on the Expression of IGF1 and MyoD Genes in Huiyang Bearded Chicken at Different Age

FAN Hongying，CHEN Yuan，ZENG Fengqun，LI Hongwei
(School of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007，Guangdong，China)

It was reported that IGF1(insulin like growth factor 1)and MYOD(muscle differentiation factor)genes play an important role in the growth，proliferation and differentiation of muscle cells.In the study samples from breast and leg muscle of Huiyang beared chickens at different day age were collected，followed by RNA extraction，reverse transcription.Polymerase chain reaction(PCR)and fluorescence quantitative PCR were used foranalyzing the expression of the two genesin breast and leg muscleof Huiyang beared chickens at different days in age.The results showed that expression of the MyoD gene is detected in breast and leg muscle of Huiyang beared chickens at 86 days old，but IGF1 gene in breast and leg muscle of Huiyang beared chickens at different days in age.These results provide new evidences for the further understanding of the expression of genes related to growth and development of muscle fiber in chickens.

Huiyang Bearded Chicken；IGF1gene；MyoD gene；fluorescence quantitative PCR

S858.31

A

1671-5934（2017）03-0061-04

2017-03-20

惠州市科技專項(xiàng)資金（2014B040008002）；廣東省普通高校特色創(chuàng)新項(xiàng)目（自然科學(xué)類）（2014KTSCX178）

作者簡(jiǎn)介：范紅英（1962-），女，廣東興寧人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物組織與生理學(xué)，Email：fhy@hzu.edu.cn