騰軍偉，趙 笑，楊亞威，張 健，趙愛(ài)梅，姜云蕓，李 柳，鄭 喆，楊貞耐*

酒曲中產(chǎn)凝乳酶微生物菌株的分離篩選及鑒定

騰軍偉，趙 笑，楊亞威，張 健，趙愛(ài)梅，姜云蕓，李 柳，鄭 喆，楊貞耐*

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京 100048）

針對(duì)酒曲中的微生物進(jìn)行分離純化，得到11 株細(xì)菌和2 株真菌，并采用酪蛋白平板法和Arima時(shí)間法篩選出了1 株產(chǎn)凝乳酶的細(xì)菌菌株編號(hào)為L(zhǎng)B-51。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌，將該產(chǎn)凝乳酶菌株命名為解淀粉芽孢桿菌GSBa-1。該菌株在液體LB培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力為（431.53±15.89）SU/mL，蛋白水解活力為（5.05±0.59）U/mL，所產(chǎn)凝乳酶凝乳活力高而蛋白水解活力低，凝乳酶粗酶單位酶活力為1.54×105SU/g。解淀粉芽孢桿菌GSBa-1是分離篩選自酒曲中的一株高產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌，因此其來(lái)源安全，可作為工業(yè)化候選菌株進(jìn)一步研究開發(fā)。

酒曲；凝乳酶；分離鑒定；解淀粉芽孢桿菌

凝乳酶（EC 3.4.23.4）是干酪加工時(shí)添加于原料乳中使乳液凝固的關(guān)鍵性酶[1]，其凝乳及蛋白水解活性對(duì)干酪的得率、質(zhì)構(gòu)和特殊風(fēng)味有著非常重要的影響[2-5]；傳統(tǒng)凝乳酶的制作是用鹽從牛犢皺胃中浸提出來(lái)。隨著世界干酪產(chǎn)量逐年上升，傳統(tǒng)凝乳酶的供應(yīng)已無(wú)法滿足現(xiàn)代干酪工業(yè)生產(chǎn)的需求。為此，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家們進(jìn)行了大量的研究以尋找凝乳酶新的來(lái)源。微生物具有生長(zhǎng)不受氣候和地域的限制，來(lái)源廣泛且發(fā)酵容易控制，生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)酶量大、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)勢(shì)，是目前最有發(fā)展?jié)摿Φ拿钢苿﹣?lái)源[6-9]。目前微生物源凝乳酶的研究主要集中在真菌的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶方面[10-12]，工業(yè)上主要采用米黑毛霉、微小毛霉和粟疫霉等真菌發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶[5]；而細(xì)菌具有較真菌體積小、繁殖快、產(chǎn)物易于提取分離、適合高密度培養(yǎng)增殖產(chǎn)酶等優(yōu)勢(shì)[13-14]，因此利用細(xì)菌工業(yè)化發(fā)酵制備凝乳酶是近年來(lái)凝乳酶研究開發(fā)的熱點(diǎn)問(wèn)題。

江米酒是我國(guó)一種傳統(tǒng)食品，由酒曲發(fā)酵江米制作而成。而宮廷奶酪是由江米酒凝固牛乳制作而成，口感細(xì)膩，具有良好的乳膠體穩(wěn)定性。其凝乳過(guò)程主要與江米酒中的凝乳酶有關(guān)[15-16]；該酶是發(fā)酵劑酒曲中的微生物發(fā)酵江米代謝的產(chǎn)物[17-18]。目前，研究者主要從酒曲中篩選得到產(chǎn)凝乳酶的霉菌，并進(jìn)行了相關(guān)的研究[19-22]。酒曲中的重要菌系——細(xì)菌，也屬于酒曲中的正常菌相；但國(guó)內(nèi)尚鮮有從酒曲中篩選高產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌的相關(guān)報(bào)道。江米酒作為一種傳統(tǒng)食品，采用其中篩選得到的菌株發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶，在食品衛(wèi)生學(xué)上是安全的。

本研究擬從江米酒中篩選高產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌，對(duì)其形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA序列分析進(jìn)行鑒定，并對(duì)其產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力及蛋白水解活力進(jìn)行測(cè)定。該研究拓寬了微生物源凝乳酶產(chǎn)生菌的菌源，為進(jìn)一步研究開發(fā)食用安全的干酪加工用細(xì)菌凝乳酶提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

酒曲產(chǎn)自江蘇蘇州；長(zhǎng)江米購(gòu)于北京市永輝超市；脫脂乳粉產(chǎn)自澳大利亞。

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L，121 ℃高壓滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂粉。yEPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉15 g/L，pH 6.0，115 ℃濕熱滅菌20 min。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉15 g/L、葡萄糖3 g/L、瓊脂粉15 g/L、蒸餾水1L，121 ℃高壓滅菌20 min。酪蛋白培養(yǎng)基：蛋白胨0.25%、葡萄糖1%、酵母膏0.1%、干酪素1%、瓊脂2%、脫脂牛乳5%，pH7.0，95 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS 12恒溫水浴加熱鍋 上海一恒科學(xué)實(shí)驗(yàn)裝備有限公司；HZQ-Q氣浴恒溫?fù)u床 哈爾濱東聯(lián)電子科技有限公司；高速離心機(jī)CR21GⅢ、U-3900分光光度計(jì)日本日立有限公司；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 江米酒的制備

按5%的酒曲添加量接種于提前蒸熟冷卻好的長(zhǎng)江米中，接著把經(jīng)滅菌冷卻好的去離子水按40%添加到江米中，攪拌均勻，30 ℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3 d。

1.3.2 江米酒中微生物的分離純化

采用梯度稀釋法將江米酒倍比稀釋，分別取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液各50 μL涂布于LB、yEPD和PDA 3 種固體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并于第2、3、5天挑取不同菌落進(jìn)一步劃線純化，直至純種，分別將其編號(hào)以作進(jìn)一步研究。

1.3.3 產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌的確定

酪蛋白法初篩產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌株：將達(dá)到純種的菌株分別以三點(diǎn)法接于酪蛋白平板上，放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d，觀察不同菌株產(chǎn)白色凝乳圈的大小和水解圈的大小。

不同培養(yǎng)基發(fā)酵復(fù)篩菌株：在產(chǎn)生凝乳圈和水解圈的菌株中，分別從平板中挑取少量菌落接種于LB、yEPD和PDA 3 種不同液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h作為活化種子液，然后按3%的接種量接于已滅菌的不同培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)后測(cè)定凝乳活力和蛋白水解活力。

1.3.4 凝乳活力的測(cè)定

酶活力根據(jù)改進(jìn)的El-Bendary等[23]的方法測(cè)定，將脫脂乳粉溶于0.01 mol/L的CaCl2溶液配制成10%的脫脂乳溶液，室溫放置30 min；于35℃中保溫5 min，35 ℃條件下，準(zhǔn)確量取待測(cè)酶液0.2 mL加入2 mL10%的脫脂乳溶液中，迅速混勻，開始計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確記錄至絮狀凝集顆粒出現(xiàn)為止。凝乳活力的定義：在40 min內(nèi)凝固100 g/L的脫脂乳1 mL所要的凝乳酶量規(guī)定是一個(gè)索氏單位（Soxhelt unit，SU），按公式（1）計(jì)算：

式中：t為凝乳時(shí)間/s；n為酶液稀釋倍數(shù)。

1.3.5 蛋白水解活力的測(cè)定

蛋白水解活力參考文獻(xiàn)[24]測(cè)定。取2 mL 1.5%酪蛋白溶液于35 ℃保溫5 min，加入0.5 mL預(yù)熱好的待測(cè)酶液混勻后繼續(xù)水浴恒溫放置60 min，然后加入2 mL 8%的三氯乙酸終止反應(yīng)，將沉淀過(guò)濾后測(cè)定濾液在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度，記為A1。制備空白樣品時(shí)，先取0.5 mL待測(cè)酶液直接與8%的三氯乙酸混合，使其立刻終止反應(yīng)，后加入2 mL 1.5%酪蛋白溶液，重復(fù)過(guò)濾步驟，濾液作為空白對(duì)照，測(cè)定其在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度，記為A2。

本實(shí)驗(yàn)條件下，60 min引起A280nm增加0.001所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位，按公式（2）計(jì)算：

1.3.6 產(chǎn)凝乳酶菌株的鑒定

1.3.6.1 形態(tài)學(xué)觀察

將產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌在LB固體平板上劃線，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)。將菌體進(jìn)行芽孢染色及革蘭氏染色后于高倍顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.3.6.2 API試劑條法對(duì)菌株鑒定

將平板中培養(yǎng)好的新鮮菌體用無(wú)菌生理鹽水溶解，根據(jù)API 50 CHB比濁法達(dá)到菌體濃度要求，然后分別加入API 50 CHB試劑盒各孔內(nèi)，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h和48 h，觀察試劑盒各孔顏色的變化。

1.3.6.3 菌株16S rDNA序列擴(kuò)增與分析

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，根據(jù)上述菌株鑒定所得由桿菌科的16S rDNA序列設(shè)計(jì)引物：正向引物P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物P2：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。以菌株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，PCR體系（20 μL）為：上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL、超純水7 μL、TaqDNA聚合酶10 μL。PCR參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)；70 ℃末端延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，將大小正確的目的片段送至北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank中選取相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，選取相似性較高的序列，與實(shí)驗(yàn)菌株一起用軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[25]。

1.3.7 產(chǎn)凝乳酶菌株生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶活力曲線的的測(cè)定

1.3.7.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

從產(chǎn)凝乳酶菌株的平板中挑取少量菌體接種于已滅菌的液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)30 h，從2 h起每隔2 h測(cè)定菌體OD600nm值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.3.7.2 酶活力曲線的測(cè)定

挑取少量LB-51菌體接入液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩12 h，作為活化種子液；以3%的接種量接種于已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，裝液量為體積分?jǐn)?shù)40%，30 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72、84、96 h時(shí)，分別按照1.3.4和1.3.5節(jié)方法測(cè)定凝乳活力和蛋白水解活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，繪制菌株產(chǎn)酶活力曲線圖。

1.3.8 菌株發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶及其分離提取

將活化的菌液以3%的接種量接種到已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心30 min以去除菌體，上清液放置于4 ℃冰箱內(nèi)冷卻2 h。向4 ℃的發(fā)酵液中加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇，使混合后的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，迅速攪拌均勻，于4 ℃冰箱中靜置過(guò)夜，4 ℃、10 000 r/min離心30 min，沉淀用0.005 mol/L的pH 5.8的磷酸鹽緩沖液溶解以防止蛋白質(zhì)凝聚或變性，溶解液放置在4 ℃冰箱中冷藏，之后于4 ℃條件下透析除鹽并冷凍干燥成酶粉。

1.3.9 凍干凝乳酶的凝乳活性評(píng)價(jià)

取0.01 g粗酶凍干粉于5 mL去離子水中，充分溶解后按照1.3.4節(jié)方法測(cè)定凝乳活力，根據(jù)公式（1）換算粗酶的單位酶活力，并與商業(yè)凝乳酶做對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒曲中產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌株的確定

2.1.1 菌株初篩

利用倍比稀釋法從發(fā)酵的江米酒中分離純化得到13 株不同菌落形態(tài)的純種菌株，將分離純化得到的13 株不同菌株分別以三點(diǎn)法點(diǎn)接于酪蛋白平板上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d，觀察并測(cè)定菌株所產(chǎn)凝乳圈及水解圈直徑（表1）。

表1 不同菌株在酪蛋白平板上凝乳圈和水解圈直徑Table 1 Diameters of hydrolysis and deposition zones of 13 strains isolated from Jiuqu in casein plate medium

從表1可以看出，LB-41D、PDA-41、PDA-61、PDA-82和yD-42這5 株菌所產(chǎn)凝乳圈和水解圈直徑為0，表明這5 株菌不產(chǎn)生凝乳酶。其余8 株菌在酪蛋白平板上都有不同大小的凝乳圈和水解圈。白色凝乳圈大說(shuō)明菌株產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力高，水解圈大說(shuō)明菌株產(chǎn)凝乳酶蛋白水解活力高。菌株所產(chǎn)凝乳酶蛋白水解活力的大小對(duì)干酪質(zhì)構(gòu)和特殊風(fēng)味有著重要的影響，蛋白水解活力高使干酪中蛋白水解過(guò)度生成苦味肽而導(dǎo)致制作的干酪有苦味，使消費(fèi)者難以接受[3-5]。所以在篩選過(guò)程中應(yīng)選取凝乳活力高而蛋白水解活力低的菌株。從有不同大小凝乳圈和水解圈的8 株不同菌株來(lái)看，其中LB-51菌株所產(chǎn)凝乳圈直徑最大同時(shí)水解圈直徑較小，由此可以初步選擇LB-51菌株為產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌。

2.1.2 菌株的復(fù)篩

將有白色凝乳圈的8 株菌分別接種于LB、yPD和PDA液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定凝乳和蛋白水解活力，結(jié)果如表2所示。

表2 菌株在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)酶活力Table 2 Rennet and proteolysis activities of 8 strains screened

由表2可知，菌株在LB中產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力相對(duì)較高，在液體PDA培養(yǎng)基中產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力最低。其中LB-51菌株在LB中發(fā)酵24 h時(shí)產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力可達(dá)320 SU/mL，在8 株菌中產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力最高，同時(shí)LB-51菌株在LB中發(fā)酵時(shí)蛋白水解活力相對(duì)較低。所以確定LB-51菌株是酒曲中產(chǎn)凝乳酶的優(yōu)勢(shì)菌。對(duì)于8 株菌株選擇了3 種不同的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，只有在LB中產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力較為理想；部分菌株在yPD和PDA中產(chǎn)酶活力不高或不產(chǎn)凝乳酶，這與培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分和比例有關(guān)[26-27]，說(shuō)明這2 種培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和比例不適合菌株產(chǎn)凝乳酶。所以3 種液體培養(yǎng)基中選擇LB作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可通過(guò)優(yōu)化其營(yíng)養(yǎng)成分和比例來(lái)進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力。

2.2 菌株初步鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

圖1 LB-51菌株菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色照片（B）Fig. 1 Colony morphology (A) and Gram staining (B) of strain LB-51

將菌株LB-51在LB固體平板上劃線培養(yǎng)48 h后，其菌落為乳白色稍顯微黃，菌落邊緣不整齊，表面粗糙有黏液，不透明。通過(guò)革蘭氏染色、芽孢染色和穿刺培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，菌株LB-51為革蘭氏反應(yīng)為陽(yáng)性，短桿狀，具有運(yùn)動(dòng)性，有芽孢，芽孢中生。

2.2.2 API生化試劑條法

將API生化試劑條法對(duì)菌株LB-51的發(fā)酵結(jié)果（表3）提交ApiWeb軟件中進(jìn)行比對(duì)鑒定，結(jié)果可初步判定菌株LB-51為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）或地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）。

表3 LB-51菌株的主要生理學(xué)特性Table 3 Physiological characteristics of strain LB-51

2.2.3 菌株16S rDNA序列擴(kuò)增結(jié)果

圖2 菌株LB-51的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis pattern of PCR amplified product of 16S rDNA from strain LB-51

以菌株LB-51基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果在約1 500 bp處有一條特異性條帶，結(jié)果見(jiàn)圖2。將PCR產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果菌株LB-51的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 450 bp。

2.2.4 基于16S rDNA序列同源性比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

圖3 以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的解淀粉芽孢桿菌GSBa-1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of Bacillus amyloliquefaciens GSBa-1 based on 16S rDNA sequence

將菌株LB-51的16S rDNA基因序列與在GenBank中序列大小相近的已知菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，然后選取與LB-51序列同源性較高的菌株序列，利用MEGA6.0軟件進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果如圖3所示，菌株LB-51與解淀粉芽孢桿菌MPA1034（HQ231913.1）在同一分支上，并通過(guò)MEGA 6.0軟件中Bootstrap的驗(yàn)證表明它們具有較高的置信度，且支持率可達(dá)100%。結(jié)合上述形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可將菌株LB-51確定為解淀粉芽孢桿菌，并進(jìn)一步將此產(chǎn)凝乳酶菌株命名為解淀粉芽孢桿菌GSBa-1。

2.3 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶活力曲線圖

圖4 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1生長(zhǎng)（A）和產(chǎn)酶活力（B）曲線Fig. 4 Growth curve (A) and rennet activity curve (B) of Bacillus amyloliquefaciens GSBa-1 as a function of culture time

由圖4A可知，OD600nm值顯示菌株LB-51在液體培養(yǎng)基中0～4 h生長(zhǎng)速率緩慢，菌體生物量幾乎不增加，處于遲緩期；在4～12 h時(shí)生長(zhǎng)速率最快，菌體細(xì)胞以幾何級(jí)數(shù)速率分裂，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在12～24 h時(shí)菌體量隨時(shí)間變化不大，基本保持平衡，處于穩(wěn)定期；24 h以后菌體量迅速減少，菌體死亡速率超過(guò)新生的速率，處于衰亡期，一般是由于營(yíng)養(yǎng)成分不足和后期代謝產(chǎn)物的增加導(dǎo)致環(huán)境變化引起的[6]。由圖4B可知，菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶在其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)產(chǎn)量很少，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)酶量也逐漸增加，在24～60 h之間產(chǎn)酶增加量不明顯；但隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，產(chǎn)酶活力明顯提高，在72 h時(shí)達(dá)到最大值，凝乳活力為（431.53±15.89） SU/mL，同時(shí)蛋白水解活力為（5.05±0.59） U/mL；之后酶活力逐漸降低，蛋白水解活力與凝乳活力變化趨勢(shì)基本相同。

2.4 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的凝乳活性評(píng)價(jià)

圖5 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶、凝乳反應(yīng)和乳清析出Fig. 5 Rennet, curd reaction and whey syneresis from Bacillus amyloliquefaciens GSBa-1

由圖5A可知，菌株GSBa-1凝乳酶粗酶為淺灰色，蓬松棉絮狀。由圖5B可知，相同的酶質(zhì)量濃度條件下，GSBa-1凝乳酶比商業(yè)酶凝乳反應(yīng)時(shí)間稍長(zhǎng)，凝塊結(jié)實(shí)且富有彈性。由圖5C可知，凝塊收縮且都伴有乳清析出現(xiàn)象，和商業(yè)酶相比，菌株GSBa-1凝乳酶乳清析出反應(yīng)不明顯。在凝乳反應(yīng)中，2 mg/mL GSBa-1凝乳酶液凝乳時(shí)間為78 s，即凝乳活力為307.69 SU/mL，菌株GSBa-1粗酶單位酶活力為1.54×105SU/g；相同質(zhì)量濃度條件下商業(yè)凝乳酶凝乳時(shí)間為36 s，單位酶活力為3.16×105SU/g。

3 討論與結(jié)論

從傳統(tǒng)安全食品宮廷奶酪的凝乳劑（江米酒酒曲）中分離篩選產(chǎn)凝乳酶的優(yōu)良菌株對(duì)發(fā)掘傳統(tǒng)飲食文化遺產(chǎn)、豐富產(chǎn)凝乳酶微生物菌源和緩解干酪加工所需凝乳酶緊張的供應(yīng)狀態(tài)有著重要的理論和實(shí)踐意義[28]。國(guó)內(nèi)已初步開展了酒曲中產(chǎn)凝乳酶微生物的分離篩選。劉振民等[29]采用酒藥作為分離源，篩選出高產(chǎn)凝乳酶霉菌菌株M10，并對(duì)該菌發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。滕國(guó)新等[30]對(duì)酒曲中產(chǎn)凝乳酶微生物進(jìn)行了分離純化研究，結(jié)果表明根霉菌為酒曲中產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌。程巧玲等[31]從酒曲中篩選得到一株霉菌、一株酵母菌和兩株細(xì)菌，并確定霉菌為產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌。本實(shí)驗(yàn)借鑒前人的研究經(jīng)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)酒曲中微生物的分離純化，共得到11 株細(xì)菌和2 株真菌；采用酪蛋白平板法初篩和不同液體培養(yǎng)基發(fā)酵復(fù)篩出一株產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌株LB-51。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌，并命名為解淀粉芽孢桿菌GSBa-1。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酒曲中存在高產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌菌株，與前人報(bào)道的霉菌是產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌株不一致，這可能與酒曲來(lái)源及種類有關(guān)[29-31]。

液體LB培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)菌株GSBa-1適宜的發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶培養(yǎng)基，該菌株在此培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力于72 h時(shí)達(dá)到最大值，為（431.53±15.89） SU/mL，且蛋白水解活力為（5.05±0.59） U/mL。凝乳酶的C/P值（凝乳活力與蛋白水解活力的比值）是干酪加工中凝固劑的一個(gè)重要的效率指標(biāo)[32]。有研究表明凝乳酶的C/P值在100～200之間時(shí)，凝乳效果最佳[30]，本實(shí)驗(yàn)菌株GSBa-1所產(chǎn)凝乳酶的C/P值為85.45，與上述比值接近，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)菌株所產(chǎn)凝乳酶適用于干酪的加工。將該菌株在最大產(chǎn)酶活力時(shí)進(jìn)行凝乳酶的提取并冷凍干燥成凝乳酶凍干粉。通過(guò)菌株凝乳酶與商業(yè)凝乳酶做凝乳效果對(duì)比分析結(jié)果顯示，該菌株凝乳酶與商業(yè)凝乳酶凝乳效果相接近，凍干粉酶活力為1.54×105SU/g與商業(yè)凝乳酶活力（3.16×105SU/g）相差不大，后期可對(duì)菌株凝乳酶進(jìn)行分離純化以獲得更高酶活力的純凝乳酶，并進(jìn)行酶學(xué)特性和相關(guān)的凝乳機(jī)理研究。此外，分離篩選的純種解淀粉芽孢桿菌GSBa-1來(lái)源于酒曲，與同來(lái)源于酒曲中的真菌相比，具有發(fā)酵易于控制，產(chǎn)物易于提取分離等優(yōu)勢(shì)，更具備產(chǎn)業(yè)化開發(fā)應(yīng)用的潛力。

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Isolation and Identification of Microbial Strains Producing Rennet from Jiuqu, a Traditional Chinese Fermentation Starter

TENG Junwei, ZHAO Xiao, YANG Yawei, ZHANG Jian, ZHAO Aimei, JIANG Yunyun, LI Liu, ZHENG Zhe, YANG Zhennai*
(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology & Business University (BTBU), Beijing 100048, China)

Eleven bacterial strains and two fungal strains were isolated from Jiuqu, a traditional Chinese fermentation starter for rice wine. Out of these, one bacterial strain, designated LB-51, capable of producing rennet was screened by the casein plate method and the Arima method. The strain was identified as Bacillus amyloliquefaciens by its morphological characteristics, physiological and biochemical tests (API 50CHB system) and 16S rDNA sequence analysis and species specific gene analysis and named as B. amyloliquefaciens GSBa-1. The rennet and proteolytic activities were (431.53 ± 15.89) SU/mL and (5.05 ± 0.59) U/mL, respectively, after 72 h shaking culture (120 r/min) at 30 ℃ for 72 h in liquid LB medium. The enzyme exhibited high milk-clotting activity and low protein hydrolysis activity. The milk-clotting activity was 1.54 × 105SU/g. B. amyloliquefaciens GSBa-1, an efficient producer and a safe source of rennet activity, is worth further research and development as a candidate strain for industrial production of rennet.

Jiuqu; rennet; isolation and identification; Bacillus amyloliquefaciens

10.7506/spkx1002-6630-201716004

TS252.1

A

1002-6630（2017）16-0023-06

騰軍偉, 趙笑, 楊亞威, 等. 酒曲中產(chǎn)凝乳酶微生物菌株的分離篩選及鑒定[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 23-38. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716004. http://www.spkx.net.cn

TENG Junwei, ZHAO Xiao, YANG Yawei, et al. Isolation and identification of microbial strains producing rennet from Jiuqu, a traditional Chinese fermentation starter[J]. Food Science, 2017, 38(16): 23-38. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716004. http://www.spkx.net.cn

2016-11-03

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371804）；北京市百千萬(wàn)人才工程資助項(xiàng)目（B類）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31601488）；2016年北京工商大學(xué)研究生科研能力提升計(jì)劃項(xiàng)目；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303085）

騰軍偉（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：tengjunwei0221@163.com

*通信作者：楊貞耐（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠芳庸ぜ敖徊鎸W(xué)科的理論和應(yīng)用。E-mail：yangzhennai@th.btbu.edu.cn