王 睿 余陳歡 方 杰

miR-409-5p對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2增殖及遷移的影響

王 睿1余陳歡2方 杰2

目的 觀察過表達(dá)miR-409-5p對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2增殖及遷移能力的影響。方法 利用miR-409-5p mimics進(jìn)行轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。高表達(dá)miR-409-5p后，使用MTT法和劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖能力及遷移能力的變化。結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)顯示，HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-409-5p mimics后細(xì)胞增長趨勢(shì)減緩，且隨miR-409-5p mimics濃度和時(shí)間成正比。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，在24 h和48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)三組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證實(shí)過表達(dá)miR-409-5p mimics的細(xì)胞體外遷移能力明顯低于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組(NC mimics)組和對(duì)照組。結(jié)論 上調(diào)miR-409-5p可抑制肝癌細(xì)胞系HepG2的增殖及遷移能力。

miR-409-5p；肝癌；增殖；遷移

肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率逐年增長。2002年全球肝癌發(fā)病數(shù)626 000例，占新發(fā)癌癥患者5.7%；死亡數(shù)達(dá)598 000人，成為全球第3位癌癥殺手[1]。雖然在病理機(jī)制及臨床治療等方面研究取得了很大進(jìn)展，但由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率較高，肝癌的預(yù)后尚不理想。microRNA是一類調(diào)控基因表達(dá)的非編碼微小RNA，通過調(diào)節(jié)下游癌基因或抑癌基因的表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡[2]。相關(guān)研究運(yùn)用基因芯片技術(shù)在動(dòng)物模型上篩選出中醫(yī)電針干預(yù)后有顯著性差異表達(dá)的miR-409-5p[3]，本研究通過觀察miR-409-5p對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖及遷移的影響，旨在進(jìn)一步確認(rèn)miR-409-5p與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞系HepG2，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院病理研究室傳代保存。LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自武漢谷歌生物科技有限公司；miR-409-5p模擬物(miR-409-5p mimics)由廣州銳博生物科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

(1)對(duì)照組；(2)NC mimics組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照microRNA NC mimics；(3)miR-409-5p模擬物組，轉(zhuǎn)染miR-409-5p mimics。具體轉(zhuǎn)染步驟按照Lipo 2000試劑說明書操作[4]。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR[5]

100 nM濃度miR-409-5p mimics組與NC mimics組進(jìn)行比較，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-409-5p的相對(duì)表達(dá)量。提取總RNA，PCR反應(yīng)體系：qRT-PCR Mix 20 μL，上下游引物各1 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4 μL，ddH2O 20 μL；反應(yīng)條件：95℃，15s→60℃，60 s，40個(gè)循環(huán)。使用Bio-Rad實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶軟件分析，采用2-△△Ct法分析miR-409-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)[6]

采用MTT法，通過測(cè)定吸光度值，評(píng)價(jià)不同濃度的miR-409-5p對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)組分別用不同濃度的miR-409-5p mimics轉(zhuǎn)染，miR-409-5p濃度設(shè)置100 nM，50 nM與25 nM，NC mimics組濃度為100 nM，對(duì)照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后換液，37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h和48 h。以每孔新鮮配制含0.2 mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)基20 μL接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔(n=6)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。并加入150 μL DMSO，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗(yàn)波長為570nm，參比波長為450nm測(cè)定光密度值。抑制率%=(1-OD實(shí)驗(yàn)/OD對(duì)照)×100%。

1.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)[7]

通過測(cè)定給藥前后同一位置不同時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度，評(píng)價(jià)miR-409-5p對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞遷移的影響。取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合到90%左右時(shí)，用200 μL移液器槍頭沿空的中軸輕劃出一道痕，每孔平行劃5道，根據(jù)分組情況分別加入100 nM miR-409-5p mimics，100 nM NC mimics進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對(duì)照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基。用顯微鏡放大100倍拍照，依次拍攝各組在同一劃痕下0 h、24 h、48 h照片，采用顯微鏡測(cè)量尺測(cè)量同一位置不同時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度，重復(fù)6次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-409-5p在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況

miR-409-5p mimics組與NC mimics組表達(dá)的miR-409-5p擴(kuò)增倍數(shù)分別為1.00±0.11和0.12±0.03。與NC mimics組細(xì)胞系相比，miR-409-5p mimics組HepG2的miR-409-5p的表達(dá)上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.2 抑制HepG2增殖活性

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-409-5p模擬物后細(xì)胞增長趨勢(shì)減緩，且隨miR-409-5p mimics濃度的提高和時(shí)間增長成正比關(guān)系。通過OD值計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h和48h后，miR-409-5p mimics組三個(gè)濃度和NC mimics組的抑制率逐漸降低(表1，圖1)。

表1 miR-409-5p對(duì)HepG2增殖抑制率的影響

2.3 抑制HepG2遷移能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，開始轉(zhuǎn)染后，三組鏡下細(xì)胞遷移寬度間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染24 h后，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-409-5p mimics組優(yōu)于對(duì)照組與NC mimics組；轉(zhuǎn)染48 h后，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-409-5p mimics組亦優(yōu)于對(duì)照組與NC mimics組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-409-5p mimics的細(xì)胞體外遷移能力明顯低于NC mimics組(圖2，表2)。

圖1 HepG2增殖抑制率趨勢(shì)圖Figure 1 The cell viability of HepG2 cells treated with miR-409-5p mimics or NC mimics

圖2 miR-409-5p對(duì)HepG2細(xì)胞劃痕寬度的影響(100×)Figure 2 Effects of miR-409-5p on scribing width in HepG2 cells(100×)

GroupsDosage(nM)0h 24h 48hControlgroup-0．308±0．0020．239±0．0050．156±0．002miR-409-5pmimicsgroup1000．315±0．0030．275±0．005?0．184±0．002?NCmimicsgroup1000．314±0．0060．232±0．004?#0．162±0．002?#

Note：compared with control group，*P<0.05；compared with miR-409-5p mimics group，#P<0.05.

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤死亡順位中占第2位[8]。隨著2006年WHO提出腫瘤是一種慢性的可控性疾病，“帶瘤生存”的理念逐漸被醫(yī)生和患者所接受[9-10]。中醫(yī)藥作為腫瘤治療最重要的輔助手段，有經(jīng)濟(jì)安全等優(yōu)點(diǎn)，在抗癌過程中如何合理的加以運(yùn)用，是目前研究的熱點(diǎn)。

miRNA調(diào)控基因的作用方式是結(jié)合到mRNA的3′-UTR(3′untranslated region，3′-UTR)，直接使靶基因降解或者抑制靶基因的翻譯過程而影響靶基因的表達(dá)，屬于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的一類分子。研究發(fā)現(xiàn)大約50%的miRNA在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)，易于發(fā)生缺失、擴(kuò)增或轉(zhuǎn)位。表明miRNA是腫瘤發(fā)生微環(huán)境中非常重要的一種小分子，通過調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、血管形成、腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移等。

目前已有大量針對(duì)HepG2與microRNA的相關(guān)研究，如作為癌基因，miR-216b下調(diào)后，可引起靶基因FOXM1(Forkhead box protein M1)的表達(dá)上調(diào)，增高肝癌細(xì)胞的致瘤性[11]；通過抑制miR-9-3p，調(diào)控其靶基因SIRT1(Sirtuin type 1)，可削弱HepG2細(xì)胞的擴(kuò)散能力[12]。而有抑癌基因作用的miR-199a-5p高表達(dá)，通過靶基因NOR1(Oxidored-nitro domain-containing protein 1)抑制HepG2的增殖和遷移[13]；內(nèi)源性miR-122可引起HepG2細(xì)胞凋亡[14]。

本研究前期證實(shí)電針可以一定程度延緩HepG2荷瘤生長趨勢(shì)，并運(yùn)用基因芯片篩選得到組間多個(gè)表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的miRNA，從中選擇P<0.01呈上調(diào)表達(dá)的miR-409-5p，合理的推測(cè)miR-409-5p可作為抑癌基因，下調(diào)原癌基因的活性。目前尚未有miR-409-5p的有關(guān)報(bào)道，但研究證實(shí)miR-409-3p對(duì)腫瘤有明確的抑癌基因作用，發(fā)現(xiàn)miR-409-3p對(duì)人膀胱癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力有抑制作用[15]；miR-409-3p還可通過靶基因GAB1(GRB2-associated-binding protein 1)抑制大腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移[16]。對(duì)于miR-409-5p的認(rèn)識(shí)卻非常貧乏，故通過本研究觀察miR-409-5p模擬物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和遷移的影響。

本研究結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染miR-409-5p后，細(xì)胞增殖能力下降。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染miR-409-5p后遷移寬度明顯變大，證明miR-409-5p能抑制HepG2的遷移能力。研究表明，miR-409-5p抑制肝癌細(xì)胞系HepG2的增殖及遷移，促進(jìn)其凋亡。后續(xù)可運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)，預(yù)測(cè)其下游靶基因，并驗(yàn)證其作為肝癌抑癌基因可能的分子機(jī)制。

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(收稿：2016-12-16)

Effects of miR-409-5p on the proliferation and migration of hepatoma HepG2 cell line

WANGRui1，YUChenhuan2，F(xiàn)ANGJie2

1.Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310007，China；2.Zhejiang Academy of Medicial Sciences

Objective The objective of this study was to observe effects of miR-409-5p on the proliferation and migration of HepG2 cells.Methods HepG2 cells were transfected with miR-409-5p mimics and verified by Real-Time quantitative PCR.After high expression of miR-409-5p，MTT and wound healing assays were used to detect the proliferation and migration ability of HepG2 cells.Results The cell viability of HepG2 cells transfected with miR-409-5p mimics was significantly decreased in comparison with the control group and showed a dose-and time-dependent manner(P<0.05).The migration ability of cells overexpressing miR-409-5p mimics was significantly lower than that in the NC group(P<0.05).There was significant difference between the two groups at treatments for 24 h and 48 h.Conclusion Up-regulated miR-409-5p can inhibit the proliferation and migration of HepG2 cells.

miR-409-5p；HepG2；Proliferation；Migration

1.浙江省院所專項(xiàng)(No.2015D3006)；2.浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2015ZA161)

1.杭州市中醫(yī)院(杭州 310007)；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院

王睿，男，(1987-)，博士，主治醫(yī)師，從事針灸推拿機(jī)制的研究。

余陳歡，E-mail：yuchenhuan2002@163.com

R735.7

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.004