王 艷，王繼洋，王坤芃，彭志鋒，楊 霞，王川慶

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002)

鴨源雞桿菌外膜蛋白A基因克隆及結(jié)構(gòu)與功能分析

王 艷，王繼洋，王坤芃，彭志鋒，楊 霞，王川慶*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002)

為篩選鴨源雞桿菌(G.anatis)潛在的保護(hù)性抗原基因，參考GenBank中G.anatisUMN179的外膜蛋白A(OmpA)基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，對(duì)鴨源雞桿菌PDS-RZ-1-SLG(RZ)株的OmpA基因進(jìn)行克隆，并應(yīng)用相關(guān)軟件對(duì)其核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，OmpA基因大小為1 083 bp，編碼360個(gè)氨基酸；鴨源雞桿菌RZ株的OmpA與UMN179、F149及12656/12的OmpA氨基酸相似性分別為93.2%、95.2%、92.7%；OmpA蛋白分子質(zhì)量為38.4 ku，等電點(diǎn)為6.77，具有穩(wěn)定性，N端有1個(gè)疏水性的α螺旋信號(hào)肽。

鴨源雞桿菌；OmpA基因； 克隆; 結(jié)構(gòu)與功能分析

雞桿菌屬(Gallibacterium)細(xì)菌屬于巴氏桿菌科，為革蘭氏陰性菌，其中鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis)為其代表種[1]，且是健康禽類上呼吸道和下生殖道的一種常在菌。研究發(fā)現(xiàn)，該菌與蛋雞的輸卵管炎、腹膜炎、敗血癥、肝炎及呼吸道疾病密切相關(guān)，能夠造成產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和質(zhì)量下降，死亡率上升，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。由于鴨源雞桿菌本身抗原多樣性的存在[5]和當(dāng)前抗生素的濫用，使得該菌多重耐藥性危害逐年加重[6]，也使得疫苗的研制困難重重。鴨源雞桿菌致病機(jī)制復(fù)雜，目前只有少數(shù)毒力因子得到確認(rèn)。因此，對(duì)鴨源雞桿菌的毒力因子進(jìn)行研究，不僅有利于研究鴨源雞桿菌致病機(jī)制，還可為其新型疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

外膜蛋白(outer membrane proteins,OMPs)是鑲嵌于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的膜蛋白，在病原菌的致病過程中發(fā)揮重要作用，能夠激發(fā)宿主的體液免疫和細(xì)胞免疫，且具有良好的免疫保護(hù)作用，因此，可將外膜蛋白作為亞單位疫苗的主要候選抗原[7]。OmpA屬于細(xì)菌外膜蛋白家族成員之一，不僅作為細(xì)菌外膜的結(jié)構(gòu)蛋白和離子通道，還在菌體感染過程中對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲、粘附、血清抗體的產(chǎn)生、免疫逃逸及免疫靶位中扮演著重要的角色[8-11]。目前，關(guān)于鴨源雞桿菌OmpA的研究較少。為此，對(duì)鴨源雞桿菌OmpA全基因進(jìn)行擴(kuò)增，運(yùn)用生物信息學(xué)等相關(guān)軟件對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)潛在的線性B細(xì)胞抗原表位及理化特性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，旨在為OmpA基因功能的研究、鴨源雞桿菌診斷方法的建立及新型高效疫苗的研制提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

鴨源雞桿菌 PDS-RZ-1-SLG(RZ)菌株[12]、大腸桿菌(E.coli)DH5α由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病學(xué)教研室保存；載體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

酵母粉、瓊脂粉、胰蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；綿羊血瓊脂平板(鄭州安圖生物工程有限公司)；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、TaqMaster Mix、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、250 bp Ladder Marker(TaKaRa公司)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考鴨源雞桿菌 UMN179OmpA全基因序列，使用軟件Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上游引物OmpA-F：5′-ATGAAAAAGACTGCAATCGCA-3′，下游引物OmpA-R：5′-TTATTGTTCGATTGTTTGTTGGTG-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。預(yù)期片段大小為1 086 bp。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)

取-70 ℃保存的甘油菌RZ菌株于綿羊血平板劃線復(fù)蘇，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取單個(gè)菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。

1.5OmpA基因的克隆

用煮沸法粗提RZ菌株的基因組作為DNA模板，用引物OmpA-F/OmpA-R擴(kuò)增OmpA全基因。PCR反應(yīng)體系50 μL，反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，并克隆至載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR和酶切鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序鑒定。

1.6 OmpA結(jié)構(gòu)與功能分析

根據(jù)預(yù)測(cè)的氨基酸序列，使用軟件Multiple Sequence Alignment和MEGA 6.0，將RZ菌株 OmpA氨基酸序列分別與12656/12、F149及UMN179的OmpA氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。應(yīng)用Protparam軟件分析OmpA的分子質(zhì)量、氨基酸組成及等電點(diǎn)。應(yīng)用Proscale和DNAStar程序中的Protean分析OmpA的親水性和疏水性。應(yīng)用在線軟件SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)OmpA的信號(hào)肽，使用Swiss-Model運(yùn)算服務(wù)器和PRED-TMBB預(yù)測(cè)分析OmpA三級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜β桶拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[13-14]。應(yīng)用程序MegAline和在線軟件IEDB Analysis Recource預(yù)測(cè)OmpA潛在的線性B細(xì)胞抗原表位。

2 結(jié)果與分析

2.1OmpA基因克隆結(jié)果

以RZ菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增OmpA全基因，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約1 000 bp處有1條特異DNA條帶(圖1)。酶切鑒定結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pMD18-OmpA構(gòu)建成功(圖2)。成功克隆OmpA全基因，并獲得OmpA全基因核苷酸序列，序列登錄號(hào)為KY411917。

M.250 bp DNA Ladder；1.OmpA基因擴(kuò)增產(chǎn)物；2.空白對(duì)照?qǐng)D1 OmpA基因PCR擴(kuò)增

2.2 OmpA的氨基酸序列特征

測(cè)序結(jié)果顯示，RZ菌株的OmpA基因全長(zhǎng)為1 083 bp，包含了OmpA基因完整開放性閱讀框，編碼由360個(gè)氨基酸組成的外膜蛋白。RZ菌株OmpA基因核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列與鴨源雞桿菌 UMN179、12656/12及F149的OmpA氨基酸序列相似率分別為93.2%、92.7%、95.2%。MEGA 6.0軟件分析結(jié)果顯示，與12656/12、UMN179、F149菌株相比，RZ菌株OmpA在47—54位缺失8個(gè)氨基酸(N-I-Y-G-Q-D-A-Y)，在190—198位多7個(gè)氨基酸(E-N-S-A-F-A-G)(圖3)。

2.3 OmpA的理化性質(zhì)

RZ菌株OmpA由360個(gè)氨基酸組成，理論分子質(zhì)量為38.4 ku,等電點(diǎn)為6.77，分子式為C1708H2662-N470O531S4。理論半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為31.90，為穩(wěn)定蛋白。負(fù)電荷殘基數(shù)(D+E)為36個(gè)，正殘基數(shù)(R+K)為34個(gè)。OmpA由20種氨基酸組成，其中含量較高的氨基酸殘基有A(13.1%)、V(9.7%)、S(9.2%)、G(8.9%)和L(6.9%)；含量較低的氨基酸殘基有M(0.6%)、C(0.6%)、W(0.6%)。親水性分析結(jié)果顯示，OmpA在95、97、98、288、289、290位氨基酸親水性分值最高(2.44)，有較強(qiáng)的疏水性；在13位分值最低(-2.39)，有較強(qiáng)的親水性。主要疏水部位在37—64、85—104、136—154、246—264、278—297、316—332、243—360位氨基酸，主要親水部位在4—20、154—172、206—212、222—243、337—341位氨基酸。

M.250 bp DNA Ladder；1.pMD18-OmpA雙酶切；2.OmpA基因PCR產(chǎn)物圖2 重組質(zhì)粒pMD18-OmpA酶切鑒定

圖3 鴨源雞桿菌RZ菌株OmpA氨基酸序列特征及其二級(jí)結(jié)構(gòu)位點(diǎn)

2.4 OmpA信號(hào)肽及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

為進(jìn)一步了解鴨源雞桿菌RZ菌株OmpA在菌體中的分布位置，使用在線軟件SignalP 4.1 Server分析，結(jié)果顯示，OmpA存在信號(hào)肽序列，為α螺旋結(jié)構(gòu)，位于N端1—22位(圖4)，表明鴨源雞桿菌 OmpA為分泌性膜蛋白。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，OmpA為β桶狀孔道，由10個(gè)反平行β折疊片構(gòu)成，面向基質(zhì)的一側(cè)有少量短的轉(zhuǎn)角，面向外側(cè)的一端存在大量較長(zhǎng)的環(huán)(圖5)；應(yīng)用PRED-TMBB預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，OmpA存在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，為跨膜蛋白，其中37—62、86—103、133—149、179—193、216—231位氨基酸暴露于膜外；1—27、74—76、115—121、165—169、205—206、243—360位氨基酸位于膜內(nèi)部；28—36、63—73、77—85、104—114、122—132、150—164、170—178、194—204、207—215、232—242位氨基酸構(gòu)成的β折疊片為穿膜區(qū)(圖5)。

圖4 鴨源雞桿菌 RZ菌株OmpA信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.5 OmpA線性 B細(xì)胞抗原表位分析

IEDB Analysis Resource分析結(jié)果顯示，RZ菌株OmpA的主要線性B細(xì)胞抗原表位有10個(gè)，分別位于20—31、44—56、91—101、138—148、185—205、216—225、246—255、273—296、315—331、340—360位氨基酸(圖6)。

圖5 鴨源雞桿菌RZ菌株OmpA三維(A)及跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(B)預(yù)測(cè)

圖6 鴨源雞桿菌RZ菌株OmpA的線性B細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

測(cè)序結(jié)果表明，鴨源雞桿菌OmpA基因保守性很高，與UMN179、F149及12565/12菌株的OmpA基因相似性達(dá)到92.7%～97.3%，氨基酸相似性達(dá)到92.7%～95.2%；預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，鴨源雞桿菌 OmpA由20種氨基酸組成，在OmpA N端有一個(gè)22個(gè)氨基酸構(gòu)成的典型信號(hào)肽，存在部分極性氨基酸殘基和兩親性反平行β折疊片，以單體形式存在，與其他已知革蘭氏陰性菌外膜蛋白OmpA結(jié)構(gòu)相似[15-18]。氨基酸序列中存在5個(gè)膜外區(qū)域(N端37—62、86—103、133—149、179—193、216—231位)，且該蛋白質(zhì)氨基酸高變區(qū)均位于表面。這些膜外區(qū)域的變異，一方面可能通過影響蛋白質(zhì)孔道大小，調(diào)節(jié)其對(duì)不同分子的滲透性；另一方面，可能在鴨源雞桿菌接觸不同的外部環(huán)境時(shí)，為適應(yīng)環(huán)境而導(dǎo)致氨基酸改變[19]，這需要進(jìn)一步通過定點(diǎn)突變等方法來驗(yàn)證其具體變異機(jī)制。該預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步解析OmpA在鴨源雞桿菌適應(yīng)不同環(huán)境及致病機(jī)制等方面發(fā)揮的作用具有重要意義。

外膜蛋白位于病原菌表面，通常在與宿主相互作用的過程中直接呈遞給宿主的免疫系統(tǒng)，這就導(dǎo)致其更易于被免疫系統(tǒng)識(shí)別并刺激宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)，而外膜蛋白的線性B細(xì)胞抗原表位在免疫識(shí)別和結(jié)合過程中發(fā)揮著重要作用，可直接影響疫苗的免疫效果[20]。本研究對(duì)鴨源雞桿菌 OmpA氨基酸序列抗原表位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該序列中存在 10個(gè)B細(xì)胞抗原表位，2個(gè)(44—56、185—205位)處于高變區(qū)，其他8個(gè)(20—31、91—101、138—148、216—225、246—255、273—296、315—331、340—360位)均處于高度保守區(qū)。有5個(gè)抗原表位暴露于膜表面，這就提示鴨源雞桿菌 OmpA不僅具有較好的抗原性，而且不同菌株之間存在交叉免疫保護(hù)，可作為亞單位疫苗候選抗原。這一預(yù)測(cè)與巴氏桿菌科其他病原菌OmpA的研究相符[11,21-22]。

本研究通過對(duì)鴨源雞桿菌 OmpA分子特征進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，OmpA位于病原菌表面，高度保守且穩(wěn)定存在，其氨基酸的高變區(qū)均位于胞外環(huán)，具有多個(gè)高度保守的線性B細(xì)胞抗原表位。預(yù)測(cè)分析并不能完全真實(shí)地反映其天然狀態(tài)，但是卻可以簡(jiǎn)化篩選過程，對(duì)進(jìn)一步深入研究其抗原性和免疫原性具有很好的參考價(jià)值，也對(duì)進(jìn)一步解析鴨源雞桿菌的致病機(jī)制具有指導(dǎo)意義。

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Cloning of the Outer Membrane Protein A Gene ofGallibacteriumanatisand Analysis of Its Structure and Function

WANG Yan,WANG Jiyang,WANG Kunpeng,PENG Zhifeng,YANG Xia,WANG Chuanqing*

(Animal Science and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

To screen potential protective antigen genes for developing genetic engineering vaccine ofGallibacteriumanatis,a pair of primers were designed according toG.anatisUMN179OmpAgene sequence published in Genbank,and theOmpAgene ofG.anatisPDS-RZ-1-SLG was cloned and sequenced.In addition,the bioinformatics analyses ofOmpAnucleotide and amino acid sequences were made with bioinformatics tools and online servers.The results showed that theOmpAgene was 1 083 bp in size,encoding 360 amino acid residues.Compared with the amino acid sequences of theOmpAofG.anatisUMN179,F149 and 12656/12,the similarity were 93.2%，95.2% and 92.7%,respectively.OmpA is a stable protein,with a relative molecular weight of 38.4 ku and a isoelectric point of 6.77,containing a hydrophobic leader peptide region,which is likely to consist of a long stretch of α helical structures in N-terminal end.

Gallibacteriumanatis;OmpAgene; cloning； structure and function analysis

2017-03-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(3177130375)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)與支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(14IRTSHN015)

王 艷(1990-)，女，河南信陽(yáng)人，在讀碩士研究生，研究方向：動(dòng)物傳染病發(fā)病機(jī)制及防制。 E-mail：1078070117@qq.com

*通訊作者：王川慶(1954-)，男，河南濮陽(yáng)人，教授，博士，主要從事動(dòng)物傳染病發(fā)病機(jī)制及防制研究。 E-mail：wchuanq@163.com

S831.7

A

1004-3268(2017)08-0147-05