姜成紅,耿鑫鑫,魏文輝,姜慧芳

(中國農(nóng)業(yè)科學院 油料作物研究所/農(nóng)業(yè)部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室,湖北 武漢 430062)

甘藍型油菜株高QTL定位及主效QTL區(qū)間候選基因預測

姜成紅,耿鑫鑫,魏文輝*,姜慧芳*

(中國農(nóng)業(yè)科學院 油料作物研究所/農(nóng)業(yè)部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室,湖北 武漢 430062)

為了研究油菜株高的遺傳基礎(chǔ)，以2個甘藍型油菜株系DH-7-9(矮桿)× DH-G-42(高桿)雜交后代連續(xù)自交的重組自交系群體(190個家系)為材料，在西寧和武漢2種環(huán)境下進行株高性狀鑒定，結(jié)果顯示，該重組自交系群體的株高表現(xiàn)連續(xù)變異并且符合正態(tài)分布。利用前期構(gòu)建的遺傳連鎖圖，結(jié)合2種環(huán)境下株高性狀鑒定數(shù)據(jù)，采用WinQTLcart 2.5 軟件復合區(qū)間作圖法(CIM)進行QTL定位和效應估計，結(jié)果表明，在2種環(huán)境下共檢測到11個與株高性狀相關(guān)的QTL，單個QTL可解釋的表型變異為1.17%～10.45%。在A10連鎖群上，主效QTL(qPH-X-A10或qPH-W-A10)在兩環(huán)境下可重復檢測到，可解釋10.24%～10.45%的表型變異。將156個擬南芥株高基因與該主效QTL置信區(qū)間對應的油菜基因組上的723個基因進行同源比較分析，在主效QTL區(qū)域內(nèi)預測到2個株高候選基因BnaA10g07740D和BnaA10g12020D，其對應的擬南芥同源基因分別為ATGA20ox2、GA5/ATGA20ox1和STA1，均與擬南芥株高相關(guān)。

甘藍型油菜； 株高； QTL定位； 候選基因

油菜(Brassicanapus)是世界范圍內(nèi)廣泛種植的主要油料作物，也是我國唯一的冬季油料作物，我國油菜栽培面積和總產(chǎn)量均居世界第1位[1]。株高是油菜產(chǎn)量相關(guān)性狀之一，影響其株型、種植密度和抗倒伏系數(shù)，直接或間接影響油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。適宜的株高對油菜抗倒性、產(chǎn)量提高及機械收割均有重要意義[3]。油菜株高表現(xiàn)出連續(xù)變異的特點，為多基因控制的數(shù)量性狀，且受環(huán)境影響較大[4]。

近年來，利用QTL作圖和圖位克隆方法，一些影響作物株高的基因已被克隆。Ghd7是一個控制水稻穗粒數(shù)、抽穗期和株高的多效性基因，對光周期敏感，編碼產(chǎn)物為具有CCT結(jié)構(gòu)域的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。長日照條件下，Ghd7基因表達增強，引起穗粒數(shù)增加、抽穗期延遲及株高增加[5]。Ghd8是一個與Ghd7類似的同時控制水稻穗粒數(shù)、抽穗期和株高的基因，編碼CCAAT盒結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子的HAP3亞基。在長日照條件下，Ghd8能顯著延遲抽穗期，同時增加株高和每穗粒數(shù)[6]。油菜株高的QTL定位研究相對滯后，但也取得了一些進展[4,7-9]。易斌等[4]檢測到3個與油菜株高相關(guān)的QTL，分別定位于第4、第9和第10連鎖群上，解釋了9.42%～17.58%的表型變異。張倩[7]在LG1和LG2連鎖群上檢測到4個與油菜株高相關(guān)的QTL，可解釋8.54%～17.04%的表型變異。Zhang等[8]在第4和第21連鎖群上檢測到3個與油菜株高性狀相關(guān)的QTL，分別解釋28.60%、23.85%和11.11%的表型變異。張鳳啟等[9]利用SNP芯片在單一環(huán)境和多環(huán)境下共檢測到27個油菜株高QTL，位于8個連鎖群上，單個QTL可解釋的表型變異為0.70%～26.10%。盡管已知控制油菜株高的相關(guān)QTL分布在一些具體的連鎖群上[8-18]，但QTL克隆及QTL區(qū)段內(nèi)候選基因預測的相關(guān)報道較少。鑒于此，以甘藍型油菜重組自交系群體為材料，對油菜株高進行QTL定位，根據(jù)主效QTL置信區(qū)間對應的甘藍型油菜基因組序列，分析該區(qū)間的全部基因，并與Shi等[15]報道的擬南芥156個株高基因進行同源性比對，篩選候選基因，以期為后續(xù)分子標記輔助育種及相關(guān)基因克隆奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

以甘藍型油菜株系矮桿小粒材料DH-7-9為母本及高桿大粒材料DH-G-42為父本，構(gòu)建重組自交系群體，該群體包含190個株系。DH-7-9和DH-G-42均通過小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得[19]。

1.2 田間試驗與株高性狀考察

將重組自交系群體于2013年9月種植于中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所武漢市武昌區(qū)試驗田(F8)，2014年5月種植于青海省西寧市青海大學油菜繁育中心試驗田(F9)。所有田間試驗均按株系分區(qū)種植，3個重復，每小區(qū)3行，行距40 cm、株距20 cm。按常規(guī)生產(chǎn)方式進行田間管理。收獲時從每小區(qū)內(nèi)隨機選取10株，用于株高性狀的鑒定。

1.3 株高的QTL定位

利用本實驗室前期通過F2代群體構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜進行QTL定位[20]。該連鎖圖覆蓋20個連鎖群，包含228個標記，圖譜總長1 546.6 cM。采用WinQTLcart 2.5軟件復合區(qū)間作圖(CIM)法[21-22]定位該重組自交系群體的株高QTL。選用1 cM的步長，在α=0.05的水平上，利用Permutation檢驗法重復檢驗1 000次，LOD閾值設定為2.5，確定QTL在染色體上的位置及數(shù)目。QTL命名參照McCouch等[23]的規(guī)則，用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計分析表型數(shù)據(jù)。

1.4 候選基因的篩選

下載NCBI上156個與擬南芥株高相關(guān)的基因序列[15]，然后與檢測到的主效QTL置信區(qū)間對應的甘藍型油菜基因組序列[24]進行BlastN比對，篩選候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍型油菜雙親及重組自交系群體株高的表型變異

試驗所選用的甘藍型油菜矮桿株系DH-7-9和高桿株系DH-G-42在株高上存在極顯著差異，在武漢和西寧2種環(huán)境中，DH-G-42的株高均極顯著高于DH-7-9 (圖1)。統(tǒng)計分析表明，株高在重組自交系群體中呈現(xiàn)超雙親分離和連續(xù)性分布(表1，圖2)，說明株高是由多個基因控制的數(shù)量性狀，適合于QTL分析。

2.2 甘藍型油菜重組自交系群體的株高QTL定位

利用WinQTLcart 2.5軟件對2種環(huán)境下重組自交系群體的株高進行QTL分析。在西寧環(huán)境下，共檢測到5個與株高相關(guān)的QTL，分別位于A02、A07、A09、A10和C03連鎖群上，單個QTL貢獻率為1.17%～10.24%，其中1個QTL表現(xiàn)為正向加性效應，其他均表現(xiàn)為負向加性效應(表2)。在武漢環(huán)境下，共檢測到6個與株高性狀相關(guān)的QTL，分別位于A07、A08、A10、C01、C04和C07連鎖群上，單個QTL貢獻率為1.18%～10.45%，其中2個QTL表現(xiàn)為正向加性效應， 其他均表現(xiàn)為負向加性效應(表2)。位于A10連鎖群上的qPH-X-A10和qPH-W-A10遺傳貢獻率較大，分別為10.24%和10.45%，應為主效QTL。qPH-X-A10定位于分子標記MR156與Na10-E08之間，qPH-W-A10定位于分子標記Na10-E08與Ra2-E03之間，距Na10-E08較近，遺傳距離為0.046 cM(表2，圖3)。通過置信區(qū)間對比發(fā)現(xiàn)，qPH-X-A10的置信區(qū)間位于qPH-W-A10置信區(qū)間之內(nèi)，加性效應方向一致且均為正值(表2，圖3，圖4)，說明此QTL位點具有正向加性效應和增效作用，且增效等位基因來自母本DH-7-9。因此推測，qPH-X-A10與qPH-W-A10為2個環(huán)境下重復檢測到的相同QTL。A07連鎖群上的qPH-X-A07和qPH-W-A07置信區(qū)間部分重合，加性效應方向一致但均為負值(表2)，說明增效基因來自父本DH-G-42。因此，qPH-X-A07和qPH-W-A07是不同環(huán)境下檢測到的相同QTL，但是這2個QTL貢獻率都較小，分別為1.53%和3.91%。

不同大寫字母表示同一環(huán)境下親本間差異達極顯著水平 (P<0.01)圖1 在武漢和西寧環(huán)境下2個親本的株高

表1 在武漢與西寧環(huán)境下親本及重組自交系群體的株高及統(tǒng)計分析

圖2 重組自交系群體株高在武漢和西寧環(huán)境下的頻次分布

表2 西寧和武漢環(huán)境下檢測出的株高QTL

黑色為qPH-X-A10置信區(qū)間位置，白色為qPH-W-A10置信區(qū)間位置 圖3 A10連鎖群上主效QTL位置

2.3 甘藍型油菜株高主效QTL區(qū)間候選基因篩選

將上述主效QTL置信區(qū)間(物理距離約4.8 Mb)與甘藍型油菜基因組序列[24]比對，得到723個注釋基因。將這些基因與擬南芥株高基因進行同源比對，發(fā)現(xiàn)有2個株高相關(guān)基因位于主效QTL置信區(qū)間內(nèi)，分別為BnaA10g07740D和BnaA10g12020D。其中， 候選基因BnaA10g07740D在擬南芥中有2個同源基因，為ATGA20ox2和GA5/ATGA20ox1(表3)。根據(jù)擬南芥的基因功能注釋，ATGA20ox2和GA5/ATGA20ox1均參與赤霉素的生物合成[25-26]，赤霉素可以促進細胞的伸長從而引起植物株高增加[27]。候選基因BnaA10g12020D與擬南芥基因STA1同源，擬南芥STA1基因突變體Starik中非血紅素蛋白含量明顯高于野生型植株，STA1的突變導致植株的矮化[28]。

實線代表qPH-X-A10，虛線代表qPH-W-A10 圖4 A10連鎖群上主效QTL峰

表3 甘藍型油菜株高主效QTL置信區(qū)間候選基因與擬南芥相關(guān)基因的比對

3 結(jié)論與討論

株高作為油菜重要的農(nóng)藝性狀之一，對油菜產(chǎn)量的潛在影響較大，合理的株高對油菜育種非常重要，因此，定位與株高相關(guān)的QTL對發(fā)掘株高基因和培育高產(chǎn)油菜品種具有重要潛在意義。本研究所選用的2個親本材料是經(jīng)過小孢子培養(yǎng)途徑獲得的純系，且株高存在顯著差異，其重組自交系群體株高呈現(xiàn)連續(xù)分布，因此，這2個親本材料適合用于株高遺傳研究。本研究發(fā)現(xiàn)，位于A10和A07連鎖群上的株高QTL在不同環(huán)境下可重復檢測到，為穩(wěn)定表達的QTL，而其余QTL只能在1種環(huán)境下檢測到，說明株高相關(guān)基因受環(huán)境影響較大，不同環(huán)境誘導了不同的株高基因表達。

前人研究表明，油菜株高QTL主要分布在A02、A03、A07、A08、C02、C03、C06和C07連鎖群[8-18]，其中主效QTLph13b[16]、ph12.3和ph2.3[17]分別位于A02、C02和C03連鎖群。A10連鎖群上也曾有相關(guān)QTL的報道，Basunanda等[14]和Udall等[17]分別利用DH系群體在A10連鎖群上定位了株高QTL，但其貢獻率均較小。張鳳啟等[9]在A10連鎖群上定位的株高QTLqPH10-1(貢獻率9.23%)與本研究的QTL貢獻率接近，但是通過物理距離對比發(fā)現(xiàn)，其QTL峰值對應的標記與本研究中的QTL峰值對應的標記相距較遠。因此，本研究在A10連鎖群上檢測到的QTL可能為一個新的QTL。

一般認為，貢獻率在10%以上的QTL為主效QTL，LOD值越大，QTL的準確率越高。本研究在2種環(huán)境下共定位到11個QTL，除2個QTL貢獻率大于10%以外，其他QTL貢獻率均較小，其中有4個QTL貢獻率小于2%，說明控制油菜株高性狀的遺傳基礎(chǔ)比較復雜。單個環(huán)境下檢測到的QTL分布在不同連鎖群上，未見同一連鎖群出現(xiàn)多個QTL的現(xiàn)象。本研究將主效QTL定位在A10連鎖群上，但A10連鎖群上標記較少，標記之間遺傳距離較大，增加了后續(xù)目的基因克隆的難度。因此，開發(fā)親本間新的多態(tài)性分子標記，增加遺傳圖譜標記密度，是進一步精細定位目標QTL及發(fā)現(xiàn)新的主效QTL的有效途徑。

通過在QTL置信區(qū)間進行候選基因預測，可以在一定程度上驗證QTL定位的準確性。本研究在A10連鎖群上的主效QTL置信區(qū)間預測到2個候選基因，有3個擬南芥基因與其同源，同源性分別為80.4%、89.2%、90.2%，同源性較高。根據(jù)擬南芥基因功能注釋，這3個同源基因均與株高發(fā)育相關(guān)，推測A10連鎖群上的主效QTL極可能是控制株高的遺傳位點。后續(xù)將利用株高主效QTL附近的分子標記逐步構(gòu)建目的基因的近等基因系，通過精細定位和圖位克隆方法最終獲得目的基因。

[1] James C.Global review of commercialized transgenic crops[J].Curr Sci,2003,84:303-309.

[2] Hedden P.The genes of the green revolution[J].Trends Genetics,2003,19(1):5-9.

[3] 張芳.我國油菜品種審定管理與育種趨勢研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學院,2012.

[4] 易斌,陳偉,馬朝芝,等.甘藍型油菜產(chǎn)量及相關(guān)性狀的QTL分析[J].作物學報,2006,32(5):676-682

[5] Xue W,Xing Y,Weng X,etal.Natural variation inGhd7 is an important regulator of heading date and yield potential in rice[J].Nature Genetics,2008,40(6):761-767.

[6] Yan W H,Wang P,Chen H X,etal.A major QTL,Ghd8,plays pleiotropic roles in regulating grain productivity,plant height,and heading date in rice[J].Molecular Plant,2011,4(2):319-330.

[7] 張倩.甘藍型油菜主要株型性狀的遺傳分析和QTL初步定位[D].重慶:西南大學,2013.

[8] Zhang S F,Fu T D,Zhu J C,etal.QTL mapping and epistasis analysis for plant height and height to the first branch in rapeseed(BrassicanapusL.)[J].Biotechnology(Gene Cloning Functional Analysis),2007,2:232-235.

[9] 張鳳啟,劉越英,程曉輝,等.利用高密度SNP標記定位甘藍型油菜株高QTL[J].中國油料作物學報,2014,36(6):695-700.

[10] Zhao Z K,Wu L K,Nian F Z.Dissecting quantitative trait loci for boron efficiency across multiple environments inBrassicanapus[J].PLoS One,2012,7(9):e45215.

[11] Shi T X,Li R Y,Zhao Z K,etal.QTL for yield traits and their association with functional genes in response to phosphorus deficiency inBrassicanapus[J].PLoS One,2013,8(1):e54559.

[12] Ding G D,Zhao Z K,Liao Y,etal.Quantitative trait loci for seed yield and yield-related traits,and their responses to reduced phosphorus supply inBrassicanapus[J].Annals of Botany,2012,109(4):747-759.

[13] Shi J,Li R,Zou J,etal.A dynamic and complex network regulates the heterosis of yield-correlated traits in rapeseed(BrassicanapusL.)[J].PLoS One,2011,6(7):e21645.

[14] Basunanda P,Radoev M,Ecke W,etal.Comparative mapping of quantitative trait loci involved in heterosis for seedling and yield traits in oilseed rape(BrassicanapusL.)[J].Theor Appl Genet,2010,120(2):271-281.

[15] Shi J Q,Li R Y,Qiu D,etal.Unraveling the complex trait of crop yield with quantitative trait loci mapping inBrassicanapus[J].Genetics,2009,182(3):851-861.

[16] Mei D S,Wang H,Hu Q,etal.QTL analysis on plant height and flowering time inBrassicanapus[J].Plant Breeding,2009,128(5):458-465.

[17] Udall J A,Quijada P A,Lambert B,etal.Quantitative trait analysis of seed yield and other complex traits in hybrid spring rapeseed(BrassicanapusL.):2.Identification of alleles from unadapted germplasm[J].Theor Appl Genet,2006,113(4):597-609.

[18] Würschum T,Liu W,Maurer H P,etal.Dissecting the genetic architecture of agronomic traits in multiple segregating populations in rapeseed(BrassicanapusL.)[J].Theor Appl Genet,2012,124(1):153-161.

[19] 介智靖,閆曉紅,方小平,等.甘藍型油菜DH植株創(chuàng)建及其倍性的流式鑒定[J].中國油料作物學報,2010,32(3):349-353.

[20] 朱恒星,閆曉紅,方小平,等.甘藍型油菜千粒重性狀的QTL初步定位研究[J].植物遺傳資源學報,2012,13(5):843-850.

[21] Zeng Z B.Theoretical basis for separation of multiple linked gene effects in mapping quantitative trait loci[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(23):10972-10976.

[22] Zeng Z B.Precision mapping of quantitative trait loci[J].Genetics,1994,136(4):1457-1468.

[23] McCouch S R,Cho Y G,Yano M,etal.Report on QTL nomenclature[J].Rice Genet Newsl,1997,14:11-13.

[24] Chalhoub B,Denoeud F,Liu S,etal.Early allopolyploid evolution in the post-NeolithicBrassicanapusoilseed genome[J].Science,2014,345:950-953.

[25] Hedden P,Phillips A L.Gibberellin metabolism:New insights revealed by the genes[J].Trends in Plant Science,2000,5(12):523-530.

[26] Xu Y L,Li L,Wu K,etal.TheGA5 locus ofArabidopsisthalianaencodes a multifunctional gibberellin 20-oxidase:Molecular cloning and functional expression[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(14):6640-6644 .

[27] Ogawa M,Hanada A,Yamauchi Y,etal.Gibberellin biosynthesis and response duringArabidopsisseed germination[J].Plant Cell,2003,15(7):1591-1604.

[28] Kushnir S,Babiychuk E,Storozhenko S,etal.A mutation of the mitochondrial ABC transporter Sta1 leads to dwarfism and chlorosis in theArabidopsismutant starik[J].The Plant Cell,2001,13(1):89-100.

QTL Mapping of Plant Height and Prediction of Candidate Genes in Major QTL Interval ofBrassicanapus

JIANG Chenghong,GENG Xinxin,WEI Wenhui*,JIANG Huifang*

(Oil Crops Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops,Ministry of Agriculture,Wuhan 430062,China)

For studying the genetic basis controlling the plant height of rapeseed(Brassicanapus),a recombinant inbred line population(190 lines) derived from a cross between a dwarfB.napusline DH-7-9 and a tallB.napusline DH-G-42 constructed by selfing for successive generations was used as material.This population was grown in Xining and Wuhan.The plant heights of individual lines were measured.The QTLs of plant height were detected using the genetic map constructed before by the complex interval graph method(CIM) of WinQTLcart 2.5 software under two environments.The results showed that a total of 11 putative QTLs for plant height were detected under two environments,each of them explained 1.17%—10.45% of phenotypic variation.In linkage group A10,one major QTL(qPH-X-A10 orqPH-W-A10) was identified under two environments repeatedly,explaining 10.24%—10.45% of the phenotypic variation.We collected 156 genes associated with the plant height ofArabidopsisthalianaand then searched the genomic region corresponding to the major QTL confidence interval to screen the possible candidate genes inB.napus.Two candidate genes,BnaA10g07740DandBnaA10g12020D,associated with plant height were founded.They had three orthologous genesATGA20ox2,GA5/ATGA20ox1 andSTA1,all involving in plant height differentiation ofA.thaliana.

Brassicanapus； plant height； QTL mapping； candidate genes

2017-02-19

國家自然科學基金項目(31371664)；武漢市科技攻關(guān)計劃項目(2013020501010174)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(1610172012001)

姜成紅(1990-),男,湖北紅安人,在讀碩士研究生,研究方向:作物遺傳學。E-mail:jiangchenghong1234@163.com

*通訊作者：魏文輝(1971-),男,湖北紅安人,教授,博士,主要從事作物基因組學與分子育種研究。 E-mail:whwei88@hotmail.com 姜慧芳(1963-),女,湖北新洲人,研究員,博士,主要從事花生種質(zhì)資源研究。E-mail:peanut@oilcrops.cn

S565.4

A

1004-3268(2017)08-0027-05