凌 娜，楊艷敏，侯江濤，孟凡榮

(1.商丘學(xué)院 風(fēng)景園林學(xué)院，河南 商丘 476000； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450002)

酵母雙雜交篩選小麥TaMBD2互作蛋白

凌 娜1，楊艷敏1，侯江濤1，孟凡榮2*

(1.商丘學(xué)院 風(fēng)景園林學(xué)院，河南 商丘 476000； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450002)

為探討小麥甲基結(jié)合域蛋白(TaMBD2)在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控功能，以TaMBD2基因的全長(zhǎng)cDNA為模板，構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-TaMBD2，利用酵母雙雜交系統(tǒng)從小麥cDNA文庫(kù)中篩選TaMBD2互作蛋白。結(jié)果共篩選到91個(gè)菌斑顯藍(lán)色的克隆，對(duì)其進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)并測(cè)序，然后在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，共獲得8個(gè)可能與TaMBD2互作的蛋白，分別為二磷酸核苷激酶(NDPK)、ENTH結(jié)構(gòu)域蛋白、SIAN蛋白、Agenet結(jié)構(gòu)域蛋白、C2H2型鋅指蛋白、磷酸激酶和2個(gè)假定蛋白，其中最有可能的TaMBD2互作蛋白為NDPK。這些候選蛋白主要參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、抗逆、能量代謝和蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)?。其中，檢測(cè)結(jié)果中參與植物抗逆脅迫的蛋白質(zhì)為主要互作蛋白，所占比例為54.9%；參與蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)幕プ鞯鞍姿急壤秊?5.3%，其余互作蛋白所占比例較小。因此，推測(cè)TaMBD2可能主要參與植物對(duì)干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫逆境的響應(yīng)及調(diào)控。

小麥； 酵母雙雜交； TaMBD2； 互作蛋白

DNA甲基化是生物體普遍存在的一種基因修飾現(xiàn)象，其與基因表達(dá)調(diào)控等密切相關(guān)[1]。有關(guān)其調(diào)控機(jī)制的研究表明,甲基化DNA能特異結(jié)合甲基結(jié)合域蛋白(methy-binding domain protein,MBD)等反式作用因子，從而參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中依賴于DNA 甲基化的基因的表達(dá)調(diào)控[2]。

目前，關(guān)于植物MBD的研究表明，擬南芥AtMBD11被沉默表達(dá)后，植物體會(huì)發(fā)生一系列的表型變化，如葉片鋸齒狀、開(kāi)花延遲以及花器易位等[3]。MBD等調(diào)控蛋白必須與其他調(diào)控因子共同作用才能行使其生物學(xué)功能。Scebba等[4]利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtMBD7與AtPRMT11存在互作關(guān)系，AtPRMT11可以對(duì)AtMBD7進(jìn)行翻譯后甲基化修飾。Yano等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞分裂期間AtRNA2協(xié)助AtMBD7結(jié)合到染色質(zhì)上并維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。

隨著植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展,更多植物MBD基因?qū)?huì)被分離鑒定，小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，探討MBD在小麥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。Li等[6]以小麥為材料首次克隆得到了6個(gè)小麥MBD基因,命名為T(mén)aMBD1-TaMBD6。孟凡榮等[7]利用RACE技術(shù)獲得了TaMBD2的全長(zhǎng)cDNA序列，并通過(guò)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),TaMBD2基因在小麥不同葉齡葉片及種子形成過(guò)程中差異表達(dá)。目前，有關(guān)TaMBD2的具體功能研究還未見(jiàn)報(bào)道。為此，利用酵母雙雜交系統(tǒng)從小麥 cDNA 文庫(kù)中初步篩選TaMBD2的互作蛋白，為探討TaMBD2在小麥生長(zhǎng)發(fā)育中的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制積累重要資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

酵母菌株Y2HGold、Y187和酵母表達(dá)載體pGBKT7-BD、pGBKT7-AD及酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、YPDA、各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基均購(gòu)于Clontech公司，大腸桿菌DH5α為國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心保存，DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-TaMBD2的構(gòu)建 根據(jù)已知的TaMBD2基因全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)帶有NcoⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的引物TaMBD2-1(5′-CTTGCAGAATCCATGGACAG-3′)和TaMBD2-2(5′-TCGATGTCGACCACTGGGTA-3′)，以實(shí)驗(yàn)室保存的pBS-TaMBD2質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段,連接pGEM-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性克隆，然后提取質(zhì)粒；利用內(nèi)切酶NcoⅠ和SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-TaMBD2和酵母表達(dá)載體pGBKT7-BD，純化產(chǎn)物經(jīng)連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增及酶切鑒定正確后，進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.2 Western blot檢測(cè)誘餌蛋白TaMBD2的表達(dá) 將pGBKT7-TaMBD2 誘餌載體轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，30 ℃培養(yǎng) 3 d，挑取單菌落利用酵母表達(dá)載體pGBKT7-BD的通用引物pGBKT7-1(5′-TCATCGGAAGAGAGTAGT-3′)和pGBKT7-2(5′-GAGTCACTTTAAAATTTGTAT-3′)進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的單克隆接種于 5 mL 的液體培養(yǎng)基 SD/-Trp中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，采用Urea/SDS法提取酵母蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.2.3 酵母雙雜交誘餌蛋白TaMBD2的毒性和誘餌載體pGBKT7-TaMBD2的自激活檢測(cè) 將誘餌載體pGBKT7-TaMBD2和空載體pGBKT7-BD分別轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別涂布在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal(SD/X)、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA(SD/X/A)培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察平板上的菌斑生長(zhǎng)情況以判斷誘餌載體在酵母細(xì)胞中是否有自激活作用和誘餌蛋白是否有毒性作用。

1.2.4 酵母雙雜交篩選TaMBD2互作蛋白 從含有pGBKT7-TaMBD2 的酵母 Y2HGold培養(yǎng)平板SD/-Trp上挑取1個(gè)單克隆于 50 mL SD/-Trp培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8，吸取4～5 mL培養(yǎng)液和1 mL Y187 小麥 cDNA 文庫(kù)置于50 mL含有50 μg/mL 卡那霉素的2×YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、50 r/min培養(yǎng)24 h，用相差顯微鏡(40×)檢測(cè)培養(yǎng)液，觀察合子的出現(xiàn)，將培養(yǎng)液分別涂布 SD/-Trp平板5～10個(gè)、SD/-Leu平板 5～10個(gè)、SD/-Leu/-Trp(DDO)平板 5～10個(gè)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)平板50～60個(gè)，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，從QDO平板上挑選白色菌斑劃線培養(yǎng)于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA(QDO/X/A )平板上,30 ℃培養(yǎng)3～5 d。用酵母表達(dá)載體pGBKT7-AD通用性引物pGADT7-1 (5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCCA-3′)和pGADT7-2(5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′)對(duì)藍(lán)色菌斑進(jìn)行菌液 PCR 擴(kuò)增，測(cè)序，在NCBI上對(duì)TaMBD2互作蛋白序列用BLAST進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGBKT7-TaMBD2的構(gòu)建和鑒定

以pBS-TaMBD2質(zhì)粒為模板，TaMBD2-1和TaMBD2-2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在目的基因中引入NcoⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，然后連接pGEM-T載體構(gòu)建pGEM-TaMBD2質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定，獲得了約為991 bp 的DNA 片段(圖1A)。經(jīng)測(cè)序分析顯示,pGEM-TaMBD2載體中TaMBD2基因序列無(wú)異常且引入了NcoⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)。

利用NcoⅠ和SalⅠ雙酶切pGEM-TaMBD2和 pGBKT7 載體，酶切產(chǎn)物回收并用 T4連接酶連接，構(gòu)建重組載體pGBKT7-TaMBD2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，用引物pGBKT7-1和pGBKT7-2進(jìn)行陽(yáng)性鑒定(圖1B)，將陽(yáng)性菌液送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，用HindⅢ酶切后,獲得大小約為1 498、1 881、4 938 bp的3個(gè)片段(圖1C)，證明誘餌載體pGBKT7-TaMBD2構(gòu)建成功。

A.pGEM-TaMBD2菌液PCR鑒定結(jié)果;B.pGBKT7-TaMBD2菌液PCR鑒定結(jié)果;C.pGBKT7-TaMBD2質(zhì)粒 Hind III酶切結(jié)果;M.1 kb plus DNA ladder圖1 pGEM-TaMBD2和誘餌載體pGBKT7-TaMBD2的鑒定結(jié)果

2.2 Western blot 檢測(cè)誘餌蛋白TaMBD2的表達(dá)

采用Urea/SDS法分別提取轉(zhuǎn)化pGBKT7-TaMBD2、陽(yáng)性對(duì)照pGBKT7-AtMBD7的酵母細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化誘餌載體(空白對(duì)照)的酵母細(xì)胞總蛋白質(zhì)，Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，pGBKT7-TaMBD2能夠正常表達(dá)目的蛋白TaMBD2，且目的蛋白約為57 ku(圖2)。

M.蛋白質(zhì)Marker;1.陽(yáng)性對(duì)照pGBKT7-AtMBD7;2.空白對(duì)照;3.pGBKT7-TaMBD2圖2 Western blot檢測(cè)誘餌蛋白TaMBD2的表達(dá)情況

2.3 誘餌蛋白毒性和誘餌載體自激活檢測(cè)

將空載體pGBKT7-BD和pGBKT7-TaMBD2分別轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在SD/-Trp培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，結(jié)果(圖3A)顯示，含pGBKT7-TaMBD2載體酵母的培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出的菌斑與含空載體酵母的培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出的菌斑大小相差不多，說(shuō)明誘餌蛋白TaMBD2對(duì)Y2HGold酵母細(xì)胞沒(méi)有毒性。

將誘餌載體pGBKT7-TaMBD2轉(zhuǎn)化到酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞中，將100 μL轉(zhuǎn)化體系稀釋10倍，分別涂布在 SD/-Trp、SD/X、SD/X/A培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，結(jié)果(圖3B)顯示，在SD/-Trp 和SD/X上長(zhǎng)出的菌斑為白色，沒(méi)有藍(lán)色菌斑出現(xiàn)，而在SD/X/A上沒(méi)有任何菌斑生長(zhǎng)，說(shuō)明誘餌載體在Y2HGold酵母細(xì)胞中不能自發(fā)激活報(bào)告基因的表達(dá)。

2.4 TaMBD2互作蛋白的篩選

將含有pGBKT7-TaMBD2 的酵母Y2HGold與含有小麥 cDNA 文庫(kù)的酵母Y187進(jìn)行雜交。取雜交產(chǎn)物200 μL涂布在直徑為150 mm的QDO平板上，共涂布58個(gè)平板，30 ℃培養(yǎng)3 d后長(zhǎng)出64個(gè)白色菌斑(圖4)，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至5 d，共長(zhǎng)出118個(gè)白色菌斑，最后2 d長(zhǎng)出的菌斑較小，直徑在0.5～1.0 mm。

A．誘餌蛋白毒性檢測(cè)；B.誘餌載體自激活檢測(cè)；1—6.SD/-Trp 培養(yǎng)基；7.SD/X培養(yǎng)基；8.SD/X/A培養(yǎng)基圖3 誘餌蛋白毒性和誘餌載體自激活檢測(cè)

圖4 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp篩選

將118個(gè)候選克隆在QDO/X/A培養(yǎng)基上進(jìn)一步篩選(圖5)，30 ℃培養(yǎng)3 d后，其中91個(gè)長(zhǎng)出的菌斑為藍(lán)色，說(shuō)明篩選到互作蛋白，而且藍(lán)色菌斑的顏色深淺程度不同，說(shuō)明互作蛋白的相互作用強(qiáng)度可能存在差異；另外有17個(gè)長(zhǎng)出白色菌斑，10個(gè)基本未長(zhǎng)出菌斑，說(shuō)明沒(méi)有篩選到互作蛋白。

圖5 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA篩選

對(duì)91個(gè)菌斑為藍(lán)色的克隆進(jìn)行菌液 PCR 檢測(cè)(圖 6)，PCR擴(kuò)增出的目的條帶介于900～3 000 bp，回收目的條帶，用連接酶與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序。將測(cè)得序列在NCBI網(wǎng)站上采用BLAST進(jìn)行比對(duì)分析，去除重復(fù)序列后，共獲得 8個(gè)與TaMBD2互作的候選蛋白(表1)，即二磷酸核苷激酶(nucleoside diphosphate kinase，NDPK)、ENTH結(jié)構(gòu)域蛋白、SIAN蛋白、Agenet結(jié)構(gòu)域蛋白、C2H2型鋅指蛋白、磷酸激酶和一些假定蛋白。

M．1 kb plus DNA ladder;1—12.SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上顯藍(lán)菌斑的菌液PCR鑒定結(jié)果圖6 TaMBD2互作蛋白的菌液PCR鑒定結(jié)果

表1 TaMBD2互作蛋白序列分析結(jié)果

TaMBD2最有可能的互作蛋白為NDPK(NP_192839.1)，其在91個(gè)候選蛋白序列中出現(xiàn)了50次。NDPK是生物體中廣泛存在的一類酶，存在于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中，主要功能是在細(xì)胞的新陳代謝過(guò)程中維持ATP和其他三磷酸核苷(NTPs)之間的平衡，并通過(guò)催化NDP和NTP之間磷酸基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)NTP濃度。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，NDPK可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡，在高鹽和低溫等非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用；還可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程，激活G蛋白活性，參與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[8]。

保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，有23個(gè)候選蛋白序列含有典型的ENTH結(jié)構(gòu)域，其由位于N末端的大約150個(gè)氨基酸通過(guò)α-螺旋形成球狀結(jié)構(gòu)。ENTH結(jié)構(gòu)域蛋白在植物中廣泛分布，參與招募泛素化蛋白結(jié)合在特異位點(diǎn)。

SIAN蛋白(XP_002881813.1)含有305個(gè)氨基酸殘基，第171—299個(gè)氨基酸是一個(gè)SINA結(jié)構(gòu)域。E3是泛素化降解中重要的泛素連接酶，E3連接酶就是典型的SINA結(jié)構(gòu)域蛋白，其協(xié)同E2將泛素蛋白連接到底物蛋白上,使底物蛋白通過(guò)蛋白酶途徑降解來(lái)調(diào)控這一途徑。

Agenet結(jié)構(gòu)域蛋白(NP_191789.2)含722個(gè)氨基酸殘基，保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其含有4個(gè)鄰近的Agenet結(jié)構(gòu)域。其主要功能為特異結(jié)合RNA，參與DNA損傷應(yīng)答的早期反應(yīng)。

C2H2型鋅指蛋白是一類含有一到多個(gè)由大約30個(gè)氨基酸組成的“手指”型多肽結(jié)構(gòu)的蛋白，是真核生物中具有重要調(diào)控作用的一類核酸結(jié)合蛋白，其可以通過(guò)指型結(jié)構(gòu)的α-螺旋與DNA雙螺旋大溝上的特異堿基序列接觸，進(jìn)而與DNA穩(wěn)定結(jié)合。

此外，TaMBD2互作的候選蛋白中還有1個(gè)磷酸激酶，其介導(dǎo)微管的聚合和解聚過(guò)程中轉(zhuǎn)磷酸作用；2個(gè)假設(shè)蛋白，功能推測(cè)其分別為假設(shè)磷酸載體蛋白和假設(shè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,參與磷酸轉(zhuǎn)移和促使氨基酸等多肽物質(zhì)在內(nèi)膜之間的轉(zhuǎn)運(yùn)等。

綜上，這些TaMBD2互作的候選蛋白主要參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、抗逆、能量代謝和蛋白運(yùn)輸?shù)?。其中，參與植物抗逆脅迫的蛋白為主要互作蛋白，所占比例為54.9%；參與蛋白運(yùn)輸?shù)幕プ鞯鞍姿急壤秊?5.3%；其余互作蛋白所占比例較小,其中還有10.2%的假設(shè)蛋白。

3 結(jié)論與討論

蛋白質(zhì)是體內(nèi)多種生命活動(dòng)都必須依賴的物質(zhì)基礎(chǔ)，研究生物體內(nèi)蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用，有助于揭示生命的本質(zhì)。Fields等[9]在1989年創(chuàng)立了能迅速、靈敏地研究蛋白質(zhì)相互作用的酵母雙雜交技術(shù)。本研究以小麥TaMBD2為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交篩選小麥 cDNA 文庫(kù)，得到與其互作的候選蛋白，為進(jìn)一步研究TaMBD2在小麥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

孟凡榮等[7]利用RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，TaMBD2基因在葉片和種子的不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)，推斷該基因在小麥生長(zhǎng)發(fā)育及種子形成過(guò)程中發(fā)揮著某種調(diào)控功能。擬南芥MBD家族的13 個(gè)成員AtMBD1—AtMBD13可以通過(guò)招募染色體修飾因子、去乙?；负徒M蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶等抑制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，從而引起轉(zhuǎn)座子基因沉默等表達(dá)抑制[10]。

本試驗(yàn)篩選到與TaMBD2互作的主要候選蛋白有NDPK、ENTH結(jié)構(gòu)域蛋白、SIAN蛋白、Agenet結(jié)構(gòu)域蛋白和C2H2型鋅指蛋白，其中最有可能的TaMBD2互作蛋白為NDPK。NDPK蛋白可能在高鹽和低溫脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[8]。Kalthoff等[11]推測(cè)ENTH結(jié)構(gòu)域蛋白作用方式可能是使多個(gè)作用因子聚合在一起。Riezman[12]研究發(fā)現(xiàn)，SIAN蛋白參與泛素化途徑中招募泛素化蛋白結(jié)合在特定位點(diǎn)。Xie等[13]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥SINA5結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子NAC1影響側(cè)根形成。擬南芥SINA2作用于轉(zhuǎn)錄因子AtRAP2.2，參與胡蘿卜素的形成[14]。擬南芥STZ基因(C2H2型鋅指蛋白)參與冷和高鹽脅迫應(yīng)答[15]。綜上可見(jiàn)，TaMBD2互作候選蛋白大多參與植物非生物脅迫的應(yīng)答。

植物體在應(yīng)對(duì)溫度、干旱、鹽漬、高壓等環(huán)境脅迫時(shí)，為了適應(yīng)環(huán)境變化會(huì)誘導(dǎo)某些能夠抵抗逆境的基因表達(dá)。Kovarik等[16]和Steward等[17]發(fā)現(xiàn)，煙草和玉米受到冷脅迫后，其基因組甲基化水平都有所下降，由此看來(lái)，植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)與甲基化水平密切相關(guān)。MBD作為能特異結(jié)合甲基結(jié)合域的反式作用因子，也必將參與DNA甲基化在植物應(yīng)答非生物脅迫中的基因表達(dá)調(diào)控。因此，推測(cè)TaMBD2可能主要參與植物對(duì)干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫逆境的響應(yīng)及調(diào)控，但具體的作用機(jī)制及生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。

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Screening of Interacted Proteins of TaMBD2 in Wheat by Yeast Two-hybrid System

LING Na1,YANG Yanmin1,HOU Jiangtao1,MENG Fanrong2*

(1.College of Landscape Architecture,Shangqiu University，Shangqiu 476000,China；2.College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002，China)

In order to understand more regulatory functions of methyl-binding domain protein TaMBD2 during the growth and development in wheat,bait vector pGBKT7-TaMBD2 was constructed with the full length cDNA ofTaMBD2 gene as template，and the interacted proteins of TaMBD2 from wheat cDNA library were screened by yeast two-hybrid system.The result showed that a total of 91 blue clones were screened,which were analyzed through PCR and homology analysis using the BLAST in NCBI,and eight possible interacted proteins of TaMBD2 were obtained,which were nucleoside diphosphate kinase(NDPK),epsin N-terminal homology domain-containing protein,seven in absentia family protein,Agenet domain-containing protein,zinc finger C2H2type family protein,phosphate kinase and two hypothetical proteins.The most likely interacted protein of TaMBD2 was NDPK.These candidate proteins were related to mediate cell signal transduction,stress resistance,energy metabolism and protein transport,etc.Among them,the proteins involved in resistance to plant stress were the main interacted protein,the proportion was 54.9%;the proportion of proteins participated in protein transport was 25.3%,and the proportion of the rest interacted proteins was smaller.Therefore,TaMBD2 may mainly participate in response and regulation to abiotic stress,such as drought,low temperature and high salt.

wheat; yeast two-hybrid; TaMBD2; interacted proteins

2017-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30300195)

凌 娜(1986-)，女，河南商丘人，講師，碩士，主要從事植物遺傳育種研究。E-mail：lingnas1985@163.com

*通訊作者：孟凡榮(1973-),女,河南鄭州人，教授,博士,主要從事植物表觀遺傳學(xué)研究。 E-mail:mengfanrong73@yahoo.com.cn

S512.1；Q78

A

1004-3268(2017)08-0007-06