張響英，唐現(xiàn)文，陳靜波，李騰騰

(1.江蘇農牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300； 2.南京農業(yè)大學，江蘇 南京 210095)

熱應激誘導奶牛乳腺上皮細胞凋亡及其對HSP70基因表達的影響

張響英1,2，唐現(xiàn)文1，陳靜波1，李騰騰1

(1.江蘇農牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300； 2.南京農業(yè)大學，江蘇 南京 210095)

為探討熱應激對乳腺上皮細胞凋亡的影響，以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型，取對數(shù)生長期的乳腺上皮細胞分別置于39 ℃和41 ℃熱處理1 h(以37 ℃正常培養(yǎng)的細胞為對照)，在37 ℃恢復培養(yǎng)0、6、12 h后收集細胞，采用MTT法檢測細胞生長抑制率，Annexin V/PI 雙染法檢測細胞凋亡，比色法分析Caspase-3活性，熒光定量PCR檢測HSP70基因的表達水平。結果表明，39 ℃熱應激組細胞生長抑制率和死亡率高峰期均發(fā)生在熱修復6 h，細胞死亡率為15.42%，而41 ℃熱應激組發(fā)生在熱修復12 h，細胞死亡率高達23.18%；高溫處理后，Caspase-3活性呈上升趨勢；39 ℃熱應激組在熱恢復6 h，HSP70基因表達量顯著高于對照組，41 ℃熱應激組在熱恢復0、6、12 h，HSP70基因的表達量分別為對照組的3.53倍、5.61倍和2.93倍。綜上可知，高溫應激激活了Caspase-3活性，從而誘導乳腺上皮細胞凋亡，并隨高溫強度的增加而作用增強，同時高溫誘導了HSP70基因過表達，協(xié)助細胞獲得熱耐受性。

乳腺上皮細胞； 熱應激； 細胞凋亡；HSP70基因

熱應激是指機體應對環(huán)境高溫所產生的非特異性免疫應答反應。奶牛耐寒畏熱，環(huán)境溫度過高時，便會出現(xiàn)熱應激反應，導致機體代謝紊亂、產奶量下降、抗病力降低等，探索奶牛的熱應激調控機制可提高奶牛生產性能。研究發(fā)現(xiàn)，熱應激能降低細胞的活力，誘導細胞凋亡和熱休克蛋白(HSPs)表達[1-3]。HSP70作為最重要的HSPs成員，分布在各種細胞中，其在細胞內的聚集或消退與細胞耐熱性的獲得或喪失密切相關[4]。在正常狀態(tài)下，細胞內存在一定量的HSP70，無DNA結合活性的熱休克轉錄因子1(HSF-1)單體在胞漿內與HSP70結合形成復合體，當高溫應激時，外界信號刺激HSF-1活化，與熱休克元件(HSE)結合，誘導HSP表達，阻斷Caspase級聯(lián)反應，從而抑制細胞凋亡[5-6]。不同種類細胞抵抗高溫應激的能力，因熱處理溫度和時間的不同而存在差異。研究報道，間斷和持續(xù)高溫處理均可誘導奶牛乳腺上皮細胞凋亡[7-8]。本研究以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型，探討不同溫度處理對細胞凋亡及HSP70基因表達的影響，進一步揭示乳腺的熱應激調控機制，以期為緩解奶牛熱應激提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

試劑：DMEM(Gibco公司)、犢牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、MTT(Amresco公司)、Caspase-3活性檢測試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)、熒光定量PCR試劑盒(Zoonbio公司)、DEPC水(Sigma公司)、Trizol試劑(大連寶生物工程有限公司)等。

儀器：CO2培養(yǎng)箱、無菌操作臺、高速低溫離心機、WFJ7200型可見分光光度計、酶聯(lián)免疫儀、凝膠成像系統(tǒng)、FTC2000熒光定量PCR儀等。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

采用組織塊法培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞[9]。取剛屠宰的健康荷斯坦奶牛乳腺組織，剔除脂肪，剪成1～2 mm3的小塊進行接種培養(yǎng)，經(jīng)純化后取對數(shù)生長期細胞用于試驗。試驗分對照組(CK)、39 ℃熱應激組和41 ℃熱應激組。(1)對照組：37 ℃培養(yǎng)乳腺上皮細胞24 h，收集細胞；(2)39 ℃熱應激組：將正常培養(yǎng)的乳腺上皮細胞置于39 ℃處理1 h，立即放回37 ℃恢復培養(yǎng)，分別在恢復培養(yǎng)的0、6、12 h收集細胞；(3)41 ℃熱應激組：將正常培養(yǎng)的乳腺上皮細胞置于41 ℃處理1 h，立即放回37 ℃恢復培養(yǎng)，分別在恢復培養(yǎng)的0、6、12 h收集細胞。

1.3 細胞生長抑制率檢測

收集各組處理細胞，加入MTT試劑培養(yǎng)4 h，吸棄上清，然后加入DMSO，靜置30 min，在酶標儀上測定490 nm處的吸光值，計算抑制率。細胞生長抑制率=(對照組OD均值-試驗組OD 均值)/對照組OD均值×100%。

1.4 乳腺上皮細胞凋亡檢測

收集各組處理細胞，采用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡，按照試劑盒使用說明用流式細胞儀檢測，統(tǒng)計細胞凋亡數(shù)，計算細胞死亡率。細胞死亡率=細胞早期凋亡率+細胞晚期凋亡率(壞死率)。

1.5 Caspase-3活性檢測

使用Caspase-3 比色試劑盒，按照使用說明檢測Caspase-3的活性。

1.6 熒光定量PCR檢測HSP70基因表達量

從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得目的基因mRNA序列，運用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物，引物序列見表1。

表1 HSP70和GAPDH基因的熒光定量PCR引物

用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測其純度和濃度，然后反轉錄獲取cDNA，按照以下反應體系進行PCR擴增：SYBRMIX 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ROX Dye 2.5 μL，cDNA 2.0 μL，用無菌去離子水補充體系至25 μL。反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)。樣本基因HSP70的表達強度用其對應的GAPDH基因的量進行校正，即△Ct=Ct(HSP70基因)-Ct(GAPDH基因)，其相對表達量采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用SPSS17.0軟件中的One-Way ANOVA進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 熱應激對奶牛乳腺上皮細胞生長抑制率的影響

與對照組相比，39 ℃熱應激組在熱恢復0、6、12 h的細胞生長抑制率分別為14.07%(P>0.05)、 28.13%(P<0.05)和22.02%(P<0.05)，41℃熱應激組細胞生長抑制率顯著增加，熱恢復0、6、12 h分別為17.13%(P>0.05)、39.76%(P<0.01)和43.73%(P<0.01)；與39 ℃熱應激組相比，41 ℃熱應激組熱恢復0 h細胞生長抑制率差異不顯著，熱恢復6、12 h細胞抑制率分別提高了11.63個百分點(P<0.05)和21.71個百分點(P<0.01)。以上結果表明，熱應激抑制了奶牛乳腺上皮細胞的生長增殖，溫度越高抑制作用愈明顯。

2.2 熱應激對奶牛乳腺上皮細胞凋亡的影響

由表2可知，熱應激誘導乳腺上皮細胞死亡，并隨高溫強度的增加而作用增強，39 ℃熱應激組細胞死亡高峰期出現(xiàn)在熱修復6 h左右，死亡率為15.42%。與對照組相比，熱恢復6 h時，39 ℃熱應激組細胞晚期凋亡率(壞死率)提高了6.49個百分點(P<0.05)；41 ℃熱應激組細胞死亡高峰期出現(xiàn)在熱修復12 h，死亡率高達23.18%。

表2 熱應激對乳腺上皮細胞凋亡的影響

注:同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3 熱應激對奶牛乳腺上皮細胞Caspase-3活性的影響

從圖1可以看出，高溫處理后，Caspase-3活性呈上升趨勢。與對照組相比，39 ℃和41 ℃熱應激組在熱恢復0 h時，Caspase-3活性變化均不明顯，39 ℃熱應激組在熱恢復6 h時 Caspase-3活性顯著上升(P<0.05)，41 ℃熱應激組在熱恢復6、12 h，Caspase-3活性分別為對照組的4.55倍(P<0.01)、5.31倍(P<0.01)；在熱恢復6、12 h，41 ℃熱應激組Caspase-3活性顯著高于39 ℃熱應激組。提示熱應激反應激活了凋亡級聯(lián)反應中的關鍵因子Caspase-3的活性，從而引發(fā)細胞凋亡。

同一時間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同圖1 熱應激對乳腺上皮細胞Caspase-3活性的影響

2.4 熱應激對奶牛乳腺上皮細胞HSP70基因表達的影響

從圖2可以看出，與對照組相比，39 ℃熱應激組在熱恢復6 h，HSP70 基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)，41 ℃熱應激組在熱恢復0、6、12 h，HSP70基因的表達量分別為對照組的3.53倍(P<0.05)、5.61倍(P<0.01)和2.93倍(P<0.05)；在熱恢復6 h，41 ℃熱應激組HSP70基因的表達量顯著高于39 ℃熱應激組。說明熱應激可提高奶牛乳腺上皮細胞HSP70基因的轉錄水平，從而保護細胞免受傷害。

圖2 熱應激對奶牛乳腺上皮細胞HSP70基因表達的影響

3 結論與討論

乳腺細胞的增殖和凋亡共同處在動態(tài)平衡之中，這對乳腺的發(fā)育和功能的形成都有重要作用[10]。乳腺細胞凋亡是一個非常復雜的過程，不僅可自發(fā)產生，也受高溫、缺氧、射線、感染、藥物等多種因素的影響[11-13]。管英俊等[14]對原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞的研究表明，高溫可使神經(jīng)細胞的表面結構和內部微細結構發(fā)生明顯變化，降低LDH活性，誘導DNA片段形成，從而誘發(fā)原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞凋亡。杜娟等[3]報道，高溫使細胞G/M 期阻滯，誘導乳腺細胞凋亡，形態(tài)上表現(xiàn)為染色質濃縮、線粒體腫脹、空泡化、形成凋亡小體。熱應激對細胞的死亡誘導是一個延遲、漸進的過程。本試驗發(fā)現(xiàn)，39 ℃熱應激組細胞生長抑制率和死亡率高峰期均發(fā)生在熱修復6 h，而41 ℃熱應激組細胞死亡高峰期則出現(xiàn)在熱修復12 h左右，死亡率為23.18%。O’Neill等[15]將人淋巴細胞置于43 ℃環(huán)境熱處理1 h，在熱恢復12～18 h細胞凋亡達最高峰，提示高溫誘導的細胞凋亡呈時間依賴性。人的白血病細胞系HL-60細胞43 ℃熱處理1 h，熱恢復12 h出現(xiàn)死亡最高峰[16]?？梢?，細胞死亡是細胞遭受應激的后續(xù)事件，不同的應激因素，不同的細胞類型，其高峰期出現(xiàn)的時間也不一致。

Caspase家族是半胱氨酸依賴性細胞死亡蛋白酶，是細胞凋亡過程中的關鍵元件[17]，其中Caspases-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，處于凋亡級聯(lián)反應的下游，是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，是細胞程序性死亡的介導者和執(zhí)行者[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫處理后，Caspase-3活性呈上升趨勢，在熱恢復6 h和12 h，41 ℃熱應激組Caspase-3活性均顯著高于39 ℃熱應激組。正常情況下，Caspase-3以無活性的酶原形式存在于胞漿中，而在細胞凋亡早期階段，Caspase-3被激活，裂解相應的胞漿胞核底物，最終引起細胞凋亡，Caspase-3活化是細胞凋亡進入不可逆階段的標志。

HSP70是細胞在應激狀態(tài)下啟動的一系列特殊基因編碼合成的蛋白質，具有多種生物學功能，如參與分子伴侶功能，提高細胞的應激耐受性，參與細胞骨架的形成與修復等[19]。高熱、缺氧、機械刺激、射線等多種有害因素刺激均可誘導HSP70的產生[20-21]。熒光定量PCR分析結果表明，奶牛乳腺上皮細胞在41 ℃高溫應激后0～12 h內引發(fā)HSP70基因過表達，細胞凋亡率明顯增高，這與郭亮等[7]的報道相一致。這可能是因為損傷的細胞內蛋白質變性、聚集、錯折疊等現(xiàn)象大大增多，通過一系列機制誘導HSP70基因表達量上升。熱應激后，HSP70高強度表達是評價組織細胞危險性的生物標志[22]，也提高了細胞的耐熱能力。HSP使細胞產生耐熱性的分子機制可能與HSP可防止細胞內蛋白質的錯誤折疊或聚集有關。熱應激條件下，細胞DNA合成、RNA 轉錄及翻譯均會受到抑制，蛋白質發(fā)生變性、錯誤聚集甚至降解，細胞膜通透性改變[23]。Segal等[24]研究發(fā)現(xiàn)，熱應激狀態(tài)下細胞內蛋白質變性導致功能喪失，HSP70基因表達量升高，提高了細胞對高溫的耐受性。

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Effects of Heat Stress on Apoptosis and Expression ofHSP70 mRNA in Bovine Mammary Epithelial Cells

ZHANG Xiangying1，2，TANG Xianwen1，CHEN Jingbo1，LI Tengteng1

(1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou 225300，China;2.Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)

To explore the effects of heat stress on the apoptosis of the bovine mammary epithelial cells and the expression ofHSP70 mRNA,the logarithmic growth phase mammary epithelial cells were exposed to 39 ℃ and 41 ℃ for 1 h(the control group was cultured at 37 ℃),and cells were collected in the recovery times at 0,6，12 h.Cell growth inhibition rate was detected by MTT method,cell apoptosis was measured by Annexin V/PI double staining method,Caspase-3 activity was detected by colorimetric assay and the expression level ofHSP70 was tested by RQ-PCR.The results showed that the highest growth inhibition rate and maximum death rate of mammary epithelial cells occurred in the recovery 6 h against 39 ℃ and the cell mortality rate was 15.42%,while they occurred in the recovery 12 h against 41 ℃ and the largest cell mortality rate was 23.18%.After high temperature treatment,the activity of Caspase-3 increased.The expression level ofHSP70 mRNA in the recovery 6 h against 39 ℃was significantly higher than that in control.And it was 3.53 times,5.61 times and 2.93 times significantly higher than that of control in the recovery 0,6，12 h respectively against 41 ℃.This suggested that heat stress activated the activity of Caspase-3 in the mammary epithelial cells and induced cell apoptosis with the increase of temperature.At the same time,the cells over-expressedHSP70 by heat stress,and could acquire tolerance.

mammary epithelial cells; heat stress; cell apoptosis;HSP70

2017-02-26

江蘇省科技支撐計劃項目(BE2008306-2)；江蘇農牧科技職業(yè)學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201612806053P)

張響英(1974-)，女，山東煙臺人，副教授，博士，主要從事動物遺傳繁育與生物技術研究。 E-mail:724673081@qq.com

S823;Q256

A

1004-3268(2017)08-0142-05