邱 芬，辛亞龍，唐軍榮，李 斌，陳 杰，陳正宇，辛培堯*

(1.西南林業(yè)大學(xué) 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.畢節(jié)市中藥研究所，貴州 畢節(jié)551700； 3.西雙版納迪升藥業(yè)有限責(zé)任公司,云南 景洪 666100)

金鐵鎖染色體制片技術(shù)研究

邱 芬1，辛亞龍1，唐軍榮1，李 斌1，陳 杰2，陳正宇3，辛培堯1*

(1.西南林業(yè)大學(xué) 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.畢節(jié)市中藥研究所，貴州 畢節(jié)551700； 3.西雙版納迪升藥業(yè)有限責(zé)任公司,云南 景洪 666100)

以金鐵鎖組培苗根尖為材料，對(duì)其染色體制片過(guò)程中預(yù)處理、固定、解離、染色等環(huán)節(jié)的最佳處理?xiàng)l件進(jìn)行探討。結(jié)果表明，金鐵鎖根尖在室溫下用0.003 mol/L 8-羥基喹啉溶液預(yù)處理5.0 h后，放入預(yù)冷的卡諾固定液[V(無(wú)水乙醇)∶V(冰乙酸)=3∶1]中于冰水中處理30 min，然后用解離液[V(濃HCl)∶V(無(wú)水乙醇)=1∶1]處理120 s，再用卡寶品紅染色液對(duì)根尖染色25 min(先染色20 min后復(fù)染5 min)，能得到良好的鏡檢效果。金鐵鎖根尖體細(xì)胞的染色體數(shù)目為2n=2x=28，為二倍體。

金鐵鎖； 染色體； 制片技術(shù)

金鐵鎖(PsammosilenetunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu)隸屬石竹科(Caryophyllaceae)金鐵鎖屬(Psammosilene)，是我國(guó)西南地區(qū)特有的單種屬植物及傳統(tǒng)的藥用植物，又名獨(dú)定子、金絲矮陀陀、土人參等。金鐵鎖主要分布于云南、貴州、西藏等地，出現(xiàn)在橫斷山脈和金沙江沿岸海拔2 000～3 800 m處[1-3]。喜光照及濕潤(rùn)，適于生長(zhǎng)在氣溫較為溫和、年溫差較小的環(huán)境中，能在-22.4 ℃低溫生存，是一種較耐寒而不耐高溫的植物[4]。在傳統(tǒng)中藥理論里，其根具有散瘀定痛、止血、消癰排膿的功效，用于跌打損傷、風(fēng)濕胃痛、創(chuàng)傷出血等治療。金鐵鎖是云南白藥的中藥成分之一，現(xiàn)已作為稀有瀕危物種列于《中國(guó)植物紅皮書(shū)》中，是國(guó)家2級(jí)保護(hù)植物[5-7]。

利用植物染色體制片，對(duì)其體細(xì)胞染色體直接進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)以及核型分析，是植物細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)研究的重要手段。然而，在進(jìn)行這些研究前，必須要獲得效果良好的染色體制片。而制片過(guò)程中的各處理?xiàng)l件卻因所處理植物的不同而存在明顯差異。金鐵鎖染色體制片技術(shù)中各個(gè)環(huán)節(jié)的研究對(duì)于金鐵鎖的細(xì)胞學(xué)及遺傳學(xué)研究具有重要意義。已有研究以野生金鐵鎖為材料，對(duì)其染色體數(shù)目進(jìn)行了觀察和計(jì)數(shù)，但并未對(duì)制片過(guò)程中具體的處理?xiàng)l件進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明[8]。鑒于此，以金鐵鎖組培苗根尖為材料，利用常規(guī)染色法，對(duì)其染色體制片技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為金鐵鎖的遺傳改良工作提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為西南林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的金鐵鎖組培生根苗，截取根尖約1 cm備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理 將上述備用材料置于0.003 mol/L 8-羥基喹啉溶液中，于室溫條件下分別預(yù)處理 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 h，觀察不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)染色體分散和縊縮情況的影響。

1.2.2 固定 將裝有卡諾固定液[V(無(wú)水乙醇)∶V(冰乙酸)=3∶1]的離心管放入-20 ℃冰箱中預(yù)冷5 min，把經(jīng)過(guò)預(yù)處理的金鐵鎖根尖在蒸餾水中浸泡15 min后轉(zhuǎn)入離心管里，然后放入0 ℃的冰箱中處理30 min，處理后的根尖如不立刻使用可以將其放入95%乙醇溶液中浸泡，再置于70%乙醇溶液中保存在4 ℃的冰箱里過(guò)渡。

1.2.3 解離 配制解離液[V(濃HCl)∶V(無(wú)水乙醇)=1∶1]，裝入5個(gè)離心管中，將固定好的根尖用蒸餾水清洗5～6次或浸泡15 min以上，再將洗好的根尖分別放入裝有解離液的離心管解離90、105、120、135、150 s，觀察不同解離時(shí)間對(duì)染色體分散程度和壓片效果的影響。

1.2.4 染色 將解離好的根尖用蒸餾水換洗5～6次后置于載玻片上；用手術(shù)刀截取根尖前端1～2 mm的部分；然后用濾紙吸去多余的水分，滴加卡寶品紅染色液1～2滴，分別染色10 min+5 min(即先染色10 min后復(fù)染5 min，下同)、15 min+5 min、20 min+5 min、25 min+5 min、30 min+5 min，觀察不同染色時(shí)間對(duì)染色體染色效果的影響。

1.2.5 鏡檢 采用常規(guī)壓片法壓片，使用Olympus BX51型顯微鏡進(jìn)行觀察，選擇50個(gè)處于細(xì)胞分裂中期、染色體分散較好的材料統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)金鐵鎖染色體制片的影響

從表1可以看出，在0.003 mol/L 8-羥基喹啉溶液中處理不同時(shí)間，金鐵鎖根尖細(xì)胞染色體分散和縊縮程度有明顯的差異。用0.003 mol/L 8-羥基喹啉溶液對(duì)金鐵鎖根尖細(xì)胞預(yù)處理4.0 h時(shí)，染色體分散，收縮不明顯，條數(shù)不清晰，不能進(jìn)行數(shù)目的統(tǒng)計(jì)(圖1-a)；處理6.0 h時(shí)染色體較分散并收縮變短，呈點(diǎn)狀，條數(shù)模糊(圖1-c)；處理5.0 h時(shí)效果最好，染色體較分散且縊縮地較短，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)個(gè)別細(xì)胞染色體數(shù)目出現(xiàn)加倍現(xiàn)象(圖1-b)。

表1 不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)金鐵鎖染色體制片的影響

a、b、c:分別預(yù)處理4.0、5.0、6.0 h圖1 金鐵鎖染色體制片預(yù)處理效果比較

2.2 不同解離時(shí)間對(duì)金鐵鎖染色體制片的影響

不同解離時(shí)間條件下，根尖軟化、細(xì)胞分散的效果差異明顯(表2)。解離的時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞和染色體都不能分散開(kāi)(圖2-a)。隨著解離時(shí)間的增加，壓片越來(lái)越容易且細(xì)胞和染色體的分散程度越來(lái)越好，但當(dāng)解離時(shí)間超過(guò)150 s時(shí)，壓片后的細(xì)胞會(huì)破碎且細(xì)胞的染色體被破壞、溢出細(xì)胞外、有雜質(zhì)，使得鏡檢時(shí)無(wú)法統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目(圖2-b)。而使用V(濃HCl)∶V(無(wú)水乙醇)=1∶1的解離液解離120 s時(shí)解離效果較好，個(gè)別細(xì)胞的染色體數(shù)目還出現(xiàn)加倍現(xiàn)象(圖2-c)。

表2 不同解離時(shí)間對(duì)金鐵鎖染色體制片效果的影響

a: 細(xì)胞不完全分散，染色體聚攏; b: 細(xì)胞完全分散，細(xì)胞破裂，染色體分散; c: 細(xì)胞完全分散，染色體完全分散圖2 金鐵鎖根尖解離的效果

2.3 不同染色時(shí)間對(duì)金鐵鎖染色體制片的影響

解離后的根尖材料用卡寶品紅進(jìn)行不同時(shí)間的初染和復(fù)染(表3)。染色時(shí)間過(guò)短，染色體不能很好地著色(圖3-a)，隨著染色時(shí)間的延長(zhǎng)，染色效果逐漸變好，但當(dāng)染色時(shí)間超過(guò)30 min(25 min+5 min)時(shí)，不但細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁染色過(guò)深使得對(duì)染色體的區(qū)分變得困難，而且由于染液干涸沉淀留在細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)可著色的其他雜質(zhì)也被著色，從而干擾對(duì)染色體數(shù)目的統(tǒng)計(jì)(圖3-b)。用卡寶品紅對(duì)根尖染色20 min+5 min，即先染色20 min后復(fù)染5 min時(shí)，觀察到的細(xì)胞染色體條數(shù)清晰，得到的染色體的染色效果相對(duì)最好，個(gè)別細(xì)胞染色體數(shù)目還出現(xiàn)加倍的現(xiàn)象(圖3-c)。

表3 不同染色時(shí)間對(duì)金鐵鎖染色體制片效果的影響

a:染色體著色過(guò)淺； b:細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞壁和染色體著色過(guò)深； c：染色效果較好圖3 金鐵鎖根尖材料染色的效果

2.4 金鐵鎖染色體數(shù)目

利用常規(guī)壓片法制片，并用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)，選取50個(gè)分散較好的細(xì)胞進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，金鐵鎖二倍體根尖細(xì)胞的染色體數(shù)目為2n=2x=28(圖4)。

圖4 金鐵鎖根尖體細(xì)胞染色體數(shù)目

3 結(jié)論與討論

已有的研究表明，在一天中8:00—10:00為一般植物細(xì)胞有絲分裂中期的高峰期[9]。本試驗(yàn)材料為組培苗，在恒溫培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，并且組培苗一直處在組織培養(yǎng)的光培養(yǎng)階段，細(xì)胞的分裂不受溫度和光照的限制，因此，在光培養(yǎng)的任何時(shí)間段內(nèi)取材均可[10]。

劉永安等[11]認(rèn)為，為了得到比較可靠的研究結(jié)論，至少應(yīng)該統(tǒng)計(jì)30個(gè)染色體分散良好的細(xì)胞，如果材料的染色體大且數(shù)目少，可以適當(dāng)?shù)厣俳y(tǒng)計(jì)一些細(xì)胞，如果材料的染色體小且數(shù)目多則需要多統(tǒng)計(jì)一些細(xì)胞，而且只有當(dāng)所統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞材料中85%以上的細(xì)胞具有相同的染色體數(shù)目時(shí)，才能確定該植物的染色體數(shù)目。所以，為了確保結(jié)論的可靠性，本試驗(yàn)共統(tǒng)計(jì)50個(gè)金鐵鎖根尖細(xì)胞的染色體數(shù)目。這樣做既符合生物學(xué)一般的統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)定，又在一定程度上減少了試驗(yàn)中誤差的影響。在染色體制片過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了個(gè)別細(xì)胞存在加倍的現(xiàn)象。辛培堯等[12]在進(jìn)行大麻染色體制片的研究中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。這是由于材料在進(jìn)行藥物低溫預(yù)處理過(guò)程中，藥劑抑制了紡錘絲的形成，從而產(chǎn)生了染色體加倍的現(xiàn)象[13]。

早期的研究將金鐵鎖劃分在石竹科蠅子草屬，之后則認(rèn)為它的親緣關(guān)系與肥皂草屬更近[8]。張雷等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蠅子草屬植物染色體基數(shù)有多種，即x=6、8、9、10、12、14、15、17，多數(shù)為x=12。楊德奎等[15]則認(rèn)為，肥皂草的染色體數(shù)目為2n=28。錢(qián)子剛[16]研究表明，金鐵鎖的染色體基數(shù)為x=12，這與本試驗(yàn)的結(jié)果有差異。而潘躍芝等[8]通過(guò)對(duì)金鐵鎖減數(shù)分裂的觀察，認(rèn)為金鐵鎖染色體數(shù)目為2n=2x=28，減數(shù)分裂時(shí)形成14個(gè)二價(jià)體，即其染色體基數(shù)為x=14，為二倍體，這與本研究的結(jié)果相一致。而同一種植物中染色體基數(shù)也有可能存在不同，關(guān)金枝[17]研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)腥草種內(nèi)染色體基數(shù)存在3種情況，即x=8、9、12。舒紅鎖[18]在對(duì)石蒜科石蒜屬植物忽地笑不同種源的鑒定研究中發(fā)現(xiàn)，種源不同的忽地笑不僅外形有差異，且染色體數(shù)目也不同，存在多種情況，即2n=12、13、14、15、16。不同的研究結(jié)果存在差異，可能與材料的來(lái)源有著較大的關(guān)系，其具體原因有待進(jìn)一步的研究來(lái)闡明。

金鐵鎖應(yīng)用范圍廣而資源少。王壟等[19]的研究表明，金鐵鎖的主要活性成分為皂苷類(lèi)。金鐵鎖主要藥用部分為根，提高其根內(nèi)的皂苷成分含量，是其遺傳改良的主要目標(biāo)之一。多倍體植株除具有巨型性的特點(diǎn)外，其營(yíng)養(yǎng)體內(nèi)的生物合成量也隨倍性的增加而增加[20]。因此，可以通過(guò)選育金鐵鎖多倍體品種提高其藥效成分含量。而染色體制片技術(shù)是鑒定其倍性是否增加的最直接手段。本研究結(jié)果不僅可為金鐵鎖細(xì)胞學(xué)及遺傳學(xué)研究提供理論依據(jù)，也可為今后的金鐵鎖多倍體育種中倍性的鑒定提供實(shí)踐指導(dǎo)。

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Study on Chromosome Slice Technique ofPsammosilenetunicoides

QIU Fen1,XIN Yalong1,TANG Junrong1，LI Bin1,CHEN Jie2,CHEN Zhengyu3,XIN Peiyao1*

(1.Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China; 2.Bijie Institute of Traditional Chinese Medicine,Bijie 551700,China;3.Xishuangbanna Disheng Pharmaceutical Co.,Ltd.,Jinghong 666100,China)

The root tips of tissue culture seedlings ofPsammosilenetunicoideswere used as materials to find the optimum treatment condition in steps of preculture,fixing,dissociation,and dyeing in slice production process.The results showed that the good microscopic images would be obtained when the root tip ofP.tunicoideswas pretreated with 0.003 mol/L 8-hydroxyquinoline solution for 5.0 hours at room temperature,then put into the Carnoy solution[V(anhydrous ethanol)∶V(glacial acetic acid)=3∶1] and treated with ice water for 30 min,afterwards treated with dissociation solution[V(concentrated HCl)∶V(anhydrous ethanol)=1∶1] for 120 s,and finally dyed with Carbol fuchsin for 25 min(dyed for 20 min and redyed for 5 min).The chromosome number of somatic cell inP.tunicoidesroot tips is 2n=2x=28.It is diploid plant.

Psammosilenetunicoides; chromosome; slice technique

2017-03-24

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2016ZZX152)；貴州省社發(fā)公關(guān)項(xiàng)目(黔科合SY字[2015]3027號(hào))；云南省林學(xué)一級(jí)學(xué)科博士點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目；西南林業(yè)大學(xué)科研基金項(xiàng)目(XL21611)

邱 芬(1990-)，女，湖北荊州人，在讀碩士研究生，研究方向：植物遺傳育種與繁育。E-mail：331308230@qq.com

*通訊作者：辛培堯(1975-)，男，甘肅臨洮人，副教授，博士，主要從事林木遺傳育種與繁育研究。E-mail:xpytgyx@163.com

S567.23+9

A

1004-3268(2017)08-0111-05