李海峰，張月陽，曹 健，屈建航，田海龍

(1.河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001； 2.中原工學院，河南 鄭州 450007)

耐寡營養(yǎng)高效解磷菌株XMT-5的分離鑒定及解磷特性

李海峰1，張月陽1，曹 健2，屈建航1，田海龍1

(1.河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001； 2.中原工學院，河南 鄭州 450007)

為獲得更加適應寡營養(yǎng)的自然環(huán)境條件的解磷菌株，以1/4蒙金娜培養(yǎng)基從土壤中分離篩選高效解磷菌株，并對其進行鑒定，分析其生長條件及解磷機制。結果表明，從土壤中共分離獲得解磷菌9株，通過對解磷量的定量測定確定高效解磷菌株XMT-5，其最大解磷量為195.63 mg/L；從菌落特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析三方面鑒定菌株XMT-5為根瘤菌(Rhizobiumsp.)；菌株XMT-5在寡營養(yǎng)條件下可以分泌檸檬酸、酒石酸和乙酸3種有機酸，從而可使培養(yǎng)液pH值下降；菌株XMT-5可在溫度4～42 ℃、pH值4～10、NaCl質量濃度0～80 g/L以及寡營養(yǎng)條件下生長，環(huán)境適應能力較強，具有良好的應用前景。

寡營養(yǎng)； 解磷菌； 解磷特性； 生物磷肥

磷是植物生長不可或缺的三大要素之一。隨著化肥在世界范圍內(nèi)的普遍使用，土壤中的磷含量已達到400～1 200 mg/kg[1]。但是，看似豐富的磷元素卻通常以植物難以吸收利用的不溶性金屬化合物形態(tài)存在。在酸性土壤中，磷酸根一般與鐵、鋁和鎂等離子結合[2]，而在堿性土壤中則主要以磷酸鈣等形態(tài)存在[3]。除了少部分含磷有機化合物以外，土壤中可供植物直接利用的磷只有1 mg/kg,甚至更少[1]。因此，為了保證農(nóng)作物的產(chǎn)量，化肥的生產(chǎn)與使用量不斷增加，土壤中的磷化合物也被動地連年累積，而作物可利用的磷形態(tài)卻未有效增加。但是，化肥的過度施用在造成資源浪費的同時也導致了土壤質量惡化及環(huán)境污染問題[3-5]。因此，研究者一直致力于開發(fā)更加環(huán)保而且高效的磷肥類型，而對解磷菌的發(fā)現(xiàn)和深入了解，為新型生物磷肥的生產(chǎn)提供了新的希望。

解磷菌能夠將植物難以吸收利用的不溶性磷轉化為容易吸收利用的可溶性磷[6]，在促進植物生長與磷吸收的同時[7-8]，還能夠幫助植物逐漸適應酸性、缺磷等不良環(huán)境[9-11]。目前，最為認可的一種解磷機制是解磷菌通過向環(huán)境中分泌小分子量的有機酸與金屬離子螯合，從而把磷酸根釋放出來成為溶解態(tài)磷[12]。目前，已報道的解磷細菌種類很豐富，包括芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌(Rhizobium)、土壤桿菌(Agrobacterium)、微球菌(Micrococcus)、黃桿菌(Flavobacterium)、歐文氏菌(Erwinia)、沙雷氏菌(Serratia)和克雷伯氏菌(Klebsiella)等[9,11]，解磷量一般為8.7～519.5 mg/L[12-13]。除細菌以外，近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了具有解磷能力的真菌和放線菌[1]，而真菌的解磷能力普遍比較強，解磷量能夠達到181.42～956.00 mg/L[14-15]。解磷真菌的種類相對較少，主要包括青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)和根霉(Rhizopus)；能夠解磷的放線菌一般都是鏈霉菌(Streptomyces)[9]，解磷量為29.67～73.94 mg/L[1,16]。

由于解磷菌具有有效解磷、促植物生長能力以及不易導致環(huán)境污染與資源浪費等優(yōu)勢，以往很多科學工作者一直致力于開發(fā)解磷菌劑以制備更高效的生物磷肥來改善目前的不良狀況。但是，到目前為止，解磷菌劑的應用還存在一些問題：實驗室中對解磷菌的培養(yǎng)條件與自然土壤的環(huán)境條件差別太大，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分非常豐富，導致解磷菌在土壤這樣相對寡營養(yǎng)的條件下不能很好地發(fā)揮作用。所以大多數(shù)解磷菌劑在實際應用中的促生長與改善土壤結構的效果還不盡人意。因此，本研究在接近自然環(huán)境的寡營養(yǎng)條件下分離篩選解磷能力較好且環(huán)境適應性較強的高效菌株，并對其進行鑒定及解磷機制分析，以期為高效解磷菌劑的開發(fā)以及土壤肥力的提高提供優(yōu)良的菌種資源。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 樣品采集自鄭州市田間含解磷菌數(shù)量比較豐富的小麥根際土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基 1/4蒙金娜固體培養(yǎng)基(篩選培養(yǎng)基)：葡萄糖2.5 g、(NH4)2SO40.125 g、NaCl 0.075 g、KCl 0.075 g、MgSO4·7H2O 0.075 g、Ca3(PO4)22.5 g、FeSO4·7H2O 7.5 mg、MnSO4·4H2O 7.5 mg、瓊脂18 g，加蒸餾水溶解并定容至1 L，pH值7.2，設定此培養(yǎng)條件為寡營養(yǎng)條件。

1/4蒙金娜液體培養(yǎng)基：同1/4蒙金娜固體培養(yǎng)基(不添加瓊脂)。

活化培養(yǎng)基(1/10 LB培養(yǎng)基)：酵母粉0.5 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 1.0 g，加蒸餾水溶解并定容至1 L，pH值7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備與涂布 取0.5 g土樣樣品加入45 mL無菌水中，分別制成10-1、10-2、10-3、10-4等稀釋度的菌懸液，每個稀釋度取200 μL菌懸液在1/4蒙金娜固體培養(yǎng)基上涂布均勻，每個稀釋度設3個平行。 將涂布好的平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，觀察平板中菌落及透明圈的產(chǎn)生情況。

1.2.2 高效解磷菌株的篩選 將能產(chǎn)生透明圈的菌株在1/4蒙金娜固體平板上劃線純化，并分別標記為XMT-1、XMT-2、XMT-3、…，分別挑取各菌株的單菌落一環(huán)至1/4蒙金娜液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，取1 mL菌懸液于6 000 r/min離心10 min，吸取上清液200 μL，采用鉬銻抗比色法[17]檢測可溶性磷含量，并以不接種解磷菌的空白培養(yǎng)基為對照，選取解磷量最大的菌株作為高效解磷菌株。

1.2.3 高效解磷菌株的鑒定

1.2.3.1 高效解磷菌株的形態(tài)觀察及生理生化特性分析 將所得高效菌株于1/4蒙金娜固體培養(yǎng)基上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，得到單菌落并觀察形態(tài)，常規(guī)的生理生化鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]進行。

1.2.3.2 高效解磷菌株的16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建 細菌總DNA采用DNA提取試劑盒提取。擴增引物為16S rRNA基因通用引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。對16S rRNA基因進行克隆、測序與比對[19]，并利用MEGA 3.1[20]以Neighbor-joining法[21]構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 高效解磷菌株XMT-5的生長特性 將處于對數(shù)期的菌株XMT-5接種到含有100 mL pH值分別為4、5、6、7、8、9、10，溫度分別為4、15、20、28、37、42 ℃，NaCl質量濃度分別為0、10、30、50、80、100 g/L的1/4蒙金娜液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)48 h，然后用分光光度計測定OD600，每個樣品設置3個平行，計算平均值，研究寡營養(yǎng)條件下高效解磷菌株XMT-5對生長環(huán)境的適應能力。

1.2.5 高效解磷菌株XMT-5的解磷能力及培養(yǎng)液pH值變化情況 挑取生長24 h的菌株XMT-5的單菌落一環(huán)至100 mL 1/4蒙金娜液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，每天取5 mL菌液，于6 000 r/min離心10 min，吸取上清液200 μL，檢測可溶性磷含量，其余上清液用于測定pH值，考察解磷量、溶液pH值隨培養(yǎng)時間的變化情況。

1.2.6 高效解磷菌株XMT-5分泌有機酸的種類 取10 μL于1.2.5培養(yǎng)條件下產(chǎn)酸量最大時的菌液，6 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，然后用高效液相色譜儀(美國島津Waters 475，紫外檢測器Waters 487)進行有機酸種類的測定，色譜條件為：分析柱C18，規(guī)格為4.6 mm×250 mm，檢測波長為210 nm，流動相為pH值2.75的0.01 mol/L KH2PO4緩沖液，流速設置為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃[22]。

2 結果與分析

2.1 高效解磷菌株的篩選

在寡營養(yǎng)條件下，共篩選出具有解磷能力的菌株9株，各菌株的解磷情況如圖1所示。其中，菌株XMT-5、XMT-6、XMT-16的解磷能力較好，解磷量分別為183.45、164.46、157.85 mg/L，解磷能力明顯高于其他菌株，具有較好的解磷潛力。因此，確定菌株XMT-5為高效解磷菌株，用于后續(xù)研究。

圖1 耐寡營養(yǎng)解磷菌的定量篩選結果

2.2 菌株XMT-5的鑒定

本研究結合菌株XMT-5的菌落形態(tài)、生理生化特性和16S rRNA 基因序列綜合對其進行鑒定。菌株XMT-5的菌落為白色、圓形、濕潤、半透明，黏稠，甲基紅試驗、VP試驗與檸檬酸鹽利用試驗結果均為陰性，可以產(chǎn)吲哚并水解明膠。碳源利用方面結果表明，其可利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、木糖和山梨糖，但不能利用乳糖。通過對菌株16S rRNA 基因的克隆，獲得1 362 bp的序列(已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KR653316)，比對結果表明，其與根瘤菌(Rhizobiumsp.) 的16S rRNA 基因序列同源性達到100%，且系統(tǒng)發(fā)育樹的結果(圖2)也顯示，菌株XMT-5與根瘤菌屬的菌株聚在一起，所以確定菌株XMT-5為根瘤菌(Rhizobiumsp.)。

2.3 菌株XMT-5的生長特性

由圖3—5可知，在寡營養(yǎng)條件下，菌株XMT-5在溫度4～42 ℃、pH值4～10、NaCl質量濃度0～80 g/L的條件下均可生長，其最適生長條件為溫度37 ℃、pH值5～9、NaCl質量濃度0～10 g/L。表明該菌株有較廣泛的溫度適應范圍，而大多數(shù)菌株很難在低于10 ℃的條件下生長[23]，另外，能夠耐受40 ℃以上高溫的解磷菌株是在一些特殊土壤環(huán)境中用于生物解磷的必要基礎[24]；該菌株對酸堿度以及鹽度的耐受能力也比較好。因此，將該菌株在寡營養(yǎng)條件下培養(yǎng)馴化之后應該更有利于適應營養(yǎng)相對貧乏的土壤等環(huán)境。

2.4 菌株XMT-5的解磷能力及培養(yǎng)液pH值變化情況

由圖6可知，在寡營養(yǎng)條件下，菌株XMT-5的解磷能力隨培養(yǎng)時間增加呈上升—平穩(wěn)—上升—下降的趨勢，在1 d內(nèi)解磷量迅速上升到188.01 mg/L，隨后的幾天時間內(nèi)，解磷量變化幅度不大；在培養(yǎng)5 d時解磷量達到最大值，為195.63 mg/L；到培養(yǎng)6 d時，解磷量稍有降低，為184.45 mg/L。隨著培養(yǎng)時間增加，培養(yǎng)液的pH值先總體降低后稍微增加，這與菌株XMT-5的解磷能力變化趨勢大體相反。大量研究表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，溶液pH值降低，解磷量也隨之增大[25-26]，本研究結果與之部分相符，培養(yǎng)液pH值在培養(yǎng)1 d大幅度降低，解磷量大幅度提高，之后總體變化不大。另外，在營養(yǎng)物質相對稀少的培養(yǎng)條件下，菌株XMT-5的解磷量與已報道的一些解磷菌株的能力(4.04～185.63 mg/L)相比亦不遜色[22]。當然，與目前所報道的高效菌株的解磷量(400.0～519.7 mg/L)相比，尚有一定的差距[13]，這可能也與所設置的寡營養(yǎng)條件有關系。

圖2 菌株XMT-5基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 溫度對菌株XMT-5生長的影響

圖4 pH值對菌株XMT-5生長的影響

圖5 NaCl質量濃度對菌株XMT-5生長的影響

圖6 菌株XMT-5在不同培養(yǎng)時間的解磷情況及培養(yǎng)液pH值變化情況

2.5 菌株XMT-5分泌有機酸的種類

經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，菌株XMT-5主要分泌3種有機酸，分別為酒石酸、檸檬酸和草酸，所占比例分別為55.47%、22.68%和21.85%。目前研究普遍認為，解磷菌的解磷機制與其向環(huán)境中分泌的有機酸有關[13-14,27]。但是，有機酸對難溶性磷的活化作用不僅取決于有機酸的數(shù)量還決定于有機酸的種類，草酸和檸檬酸對各種難溶性磷源的解磷效果較好[13,28]。因此，菌株XMT-5在寡營養(yǎng)條件下的解磷效果應該與其向胞外分泌的有機酸種類有關。

3 結論

本研究以1/4蒙金娜固體培養(yǎng)基分離篩選到耐寡營養(yǎng)的高效解磷菌株XMT-5，經(jīng)鑒定其為根瘤菌(Rhizobiumsp.)。該菌株的最適生長條件為：溫度37 ℃、pH值5～9、NaCl質量濃度0～10 g/L，培養(yǎng)5 d時解磷量達到最大，為195.63 mg/L。另外，菌株XMT-5在溫度4～42 ℃、pH值4～10、NaCl質量濃度0～80 g/L的條件下均可生長，環(huán)境適應能力較強，經(jīng)過寡營養(yǎng)條件馴化后有較好的應用潛力。該菌株可以分泌酒石酸、檸檬酸和草酸，這可能是其解磷的一種機制。

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Isolation,Identification and Phosphorolysis Characteristics of High-efficient Phosphate-solubilizing Bacterium XMT-5 under Oligotrophic Conditions

LI Haifeng1,ZHANG Yueyang1,CAO Jian2,QU Jianhang1,TIAN Hailong1

(1.College of Bioengineering,Henan University of Technology，Zhengzhou 450001,China；2.Zhongyuan University of Technology,Zhengzhou 450007,China)

In order to obtain strains which could adapt more oligotrophic natural environmental conditions,Monkina medium diluted by 4 times was used to isolate high-efficient phosphate-solubilizing bacteria,and the bacteria were identified,the growth condition and phosphorolysis mechanism were studied.The results showed that nine phosphate-solubilizing strains were screened out,and the high-efficient phosphate-solubilizing strain XMT-5 was determined through the quantitative determination of phosphate-solubilizing quantity,which could solubilizing phosphate 195.63 mg/L.According to the colony morphology,physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis,strain XMT-5 was identified asRhizobiumsp.Under the oligotrophic condition,strain XMT-5 could secrete citric acid,tartaric acid and acetic acid,so lead to a drop of pH value.Strain XMT-5 could grow under the oligotrophic condition with 4—42 ℃,pH value of 4—10 and NaCl of 0—80 g/L.The strain had strong adaptability to the environment,and good application prospect.

oligotrophic; phosphate-solubilizing bacteria; phosphorolysis characteristics; biological phosphorus fertilizer

2017-02-20

國家自然科學基金項目(31400103,31370147)；河南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃項目(15IRTSTHN019)

李海峰(1984-)，女，河北涿鹿人，副教授，博士，主要從事微生物與磷循環(huán)研究。E-mail:hfli@haut.edu.cn

S154.39

A

1004-3268(2017)08-0067-05