孔燕凌

(駐馬店市第二中醫(yī)院制劑室，河南駐馬店463000)

HPLC同時測定墨旱蓮正丁醇有效部位含量分析

孔燕凌

(駐馬店市第二中醫(yī)院制劑室，河南駐馬店463000)

目的建立HPLC法定量同時分析中藥材墨旱蓮有效部位成分的方法，為墨旱蓮的質(zhì)量控制提供參考。方法根據(jù)臨床文獻對墨旱蓮正丁醇提取部位活性成分藥理篩選實驗結(jié)果，確定墨旱蓮正丁醇有效部位主要活性成分為（墨旱蓮皂甙A、齊墩果酸、芹菜素、木犀草素、α-三聯(lián)噻吩、(丁烯-3-炔-卜基)2，2-二聯(lián)噻吩、蟛蜞菊內(nèi)酯、去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯）。選擇市售經(jīng)鑒定的墨旱蓮，采用經(jīng)石油醚-乙酸乙酯-正丁醇提取步驟得到墨旱蓮正丁醇有效部位，采用高效液相色譜法（HPLC）對其主要活性成分進行分離、同時檢測。流動相組成：洗脫程序：。采用8種待測成分的對照品，對該HPLC方法檢測8種成分的線性關(guān)系、加樣回收率變異系數(shù)、日間精密度變異系數(shù)、重復(fù)率變異系數(shù)、穩(wěn)定性變異系數(shù)進行分析，綜合評價HPLC法定量分析墨旱蓮有效部位8種成分的價值。結(jié)果采用上述HPLC條件檢測墨旱蓮正丁醇有效部位的8種活性成分，結(jié)果顯示，8種成分墨旱蓮皂甙A、齊墩果酸、芹菜素、木犀草素、α-三聯(lián)噻吩、(丁烯-3-炔-卜基)2，2-二聯(lián)噻吩、蟛蜞菊內(nèi)酯、去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯的峰面積和濃度均呈線性關(guān)系，相關(guān)性系數(shù)均＞0.999，8種成分的加樣回收率均＞98.0%，8種成分的日間精密度變異系數(shù)、穩(wěn)定性、重復(fù)率變異系數(shù)均＜3.0%。結(jié)論HPLC法同時測定墨旱蓮有效部位的8種活性成分具有較好的穩(wěn)定性，可重復(fù)性好，回收率高。為墨旱蓮有效部位活性成分的質(zhì)量控制提供了量化手段，是適合墨旱蓮臨床主要以有效部位作為臨床應(yīng)用的特性，具有較高的應(yīng)用價值。

高效液相色譜；墨旱蓮；有效部位；活性成分；質(zhì)量控制

墨旱蓮是民間俗稱的旱蓮草、豬牙草，為菊科植物鱧腸的全草，夏、秋采收全草，清潔曬干或陰干即可入藥，無需特殊炮制。墨旱蓮原名鱧腸，始載于《唐本草》，是臨床應(yīng)用較為廣泛的中藥材[1]，具有涼血，止血，補腎，益陰的功效。臨床中醫(yī)用其治療吐血、咳血、衄血、尿血、便血、血痢、須白、白喉、淋濁、帶下、陰部濕癢等臨床疾病[2]?，F(xiàn)代藥理實驗結(jié)果表明[3，4]，墨旱蓮有效部位具有多種藥理活性，如止血、保肝、抗炎和抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗心血管疾病、抗自由基和染色體損傷、激活絡(luò)氨酸酶、降血糖、抗骨質(zhì)舒松等。由于中藥材受到產(chǎn)地、采收時機、儲存條件等諸多因素對質(zhì)量的影響，對其質(zhì)量進行評價，為規(guī)范生產(chǎn)、儲存、使用過程提供數(shù)據(jù)，保證藥材質(zhì)量，確保藥材的上述療效具有重要的價值[5]。目前中藥材的研發(fā)應(yīng)用主要以藥材有效部位為主，從中藥材中提取的單體在臨床的應(yīng)用范圍有限[7]?；诖?，本文對墨旱蓮的正丁醇提取有效部位采用高效液相色譜法（HPLC）對其主要活性成分（墨旱蓮皂甙A、齊墩果酸、芹菜素、木犀草素、α-三聯(lián)噻吩、(丁烯-3-炔-卜基)2，2-二聯(lián)噻吩、蟛蜞菊內(nèi)酯、去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯）的含量進行檢測，為臨床控制墨旱蓮藥材質(zhì)量提供參考?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 試驗用藥材、儀器設(shè)備、對照品、試劑

1.1.1 藥材、對照品藥材購自成都荷花池中藥材市場，經(jīng)本院中藥室采用中藥材顯微法鑒定為菊科植物墨旱蓮全草。墨旱蓮皂甙A（YJ-140307）、齊墩果酸（LY0506）、芹菜素（YJ-141203）、木犀草素（YJ-140502）、α-三聯(lián)噻吩（YJ-141502）、(丁烯-3-炔-卜基)2，2-二聯(lián)噻吩（YJ-141102）、蟛蜞菊內(nèi)酯（YJ-140207）、去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯（YJ-140102）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 儀器設(shè)備、試劑BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司制造)；精密天平（上海良平TG630B）、島津高效液相色譜儀，型號：LC10ATVP LC-10A進樣器：SIL-10AP，輸液泵：LC-10ATvp，檢測器：SPD-10Avp(UV-VIS)。色譜柱：Inertsil ODS-2 4.6×250mm/5μm，流動相：采用梯度洗脫，A流動相組成：乙腈：水，0.5%~1%乙酸調(diào)節(jié)pH值在3.0~5.0，B流動相組成：甲醇：0.4%的磷酸溶液，試劑：甲醇，乙醇，氯仿，石油醚（沸程：30~60℃），丙酮，乙酸乙酯，正丁醇等。

1.2 方法

1.2.1 樣供試品制備將經(jīng)鑒定的干燥墨旱蓮藥材打粉過3號篩，精密稱定100g置于1000ml具塞錐形瓶中，加入500ml乙醇精密稱重，浸提4h后，過濾，收集濾液，重復(fù)上述浸提過程2次，合并三次濾液，再分別采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)得到浸膏。分別得到石油醚有效部位浸膏、乙酸乙酯有效部位浸膏和正丁醇有效部位浸膏。精密稱取正丁醇有效部位浸膏1g采用甲醇超聲震蕩溶解，經(jīng)濾紙粗濾、0.45μm微孔濾膜精濾后，用甲醇洗脫三次，合并濾液混勻，稱重補足至1000ml，得到供試品溶液。

1.2.2 對照品溶液制備分別精密稱定墨旱蓮皂甙A、齊墩果酸、芹菜素、木犀草素、α-三聯(lián)噻吩、(丁烯-3-炔-卜基)2，2-二聯(lián)噻吩、蟛蜞菊內(nèi)酯、去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯對照品，按照說明書所采用的HPLC檢測限度配置成適宜濃度，超聲震蕩溶解，混合均勻，制成混合對照品溶液。

1.2.3 流動相配制及梯度洗脫程序A流動相組成：乙腈：0.5%乙酸=100：10，B流動相組成：甲醇：0.4%的磷酸溶液=100：10。洗脫程序：梯度洗脫條件：0~5min，A流動相10%~15%，B流動相90~ 85%，5~10min，A流動相15%~18%，B流動相85~ 82%，10~15min，A流動相18~25%，B流動相82~ 75%，15~20min，A流動相25~30%，B流動相75~ 70%，20~25min，A流動相30~40%，B流動相70~ 60%，25~30min，A流動相40~95%，B流動相60~ 5%。流動相流速控制：0.5ml/min；柱溫35℃；檢測波長210nm。

1.2.4 待測成分標準曲線制作將混合對照品按照0.5倍、1倍、5倍、10倍、20倍、40倍、80倍的系數(shù)稀釋，采用上述洗脫程序分離檢測，以各組分的峰面積為中坐標，濃度為橫坐標，繪制各待測成分的標準曲線。

1.2.5 待測成分的加樣回收試驗按照測定含量的供試品溶液濃度的80%、100%、120%含量加入對照品至供試品溶液中，檢測各待測成分的加樣回收率。

1.2.6 日間精密度將配制好的混合對照品溶液，按照設(shè)定的HPLC檢測方法在同一日內(nèi)分別按照每相隔4h的間隔進樣檢測，分別計算各成分6次檢測結(jié)果之間的變異系數(shù)。

1.2.7 重復(fù)性試驗按照1.2.1步驟分別取同一批次6份不同墨旱蓮正丁醇提取物制作供試樣品，并按照1.2.3、1.2.4設(shè)定的洗脫程序和標準曲線測定樣品含量，計算6份供試品的濃度變異系數(shù)。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗：將同一份供試品溶液分別與配制完成后的即刻、2h、4h、6h、8h、12h測定樣品含量，計算6次不同時間含量檢測結(jié)果的變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線8種成分墨旱蓮皂甙A、齊墩果酸、芹菜素、木犀草素、α-三聯(lián)噻吩、(丁烯-3-炔-卜基) 2，2-二聯(lián)噻吩、蟛蜞菊內(nèi)酯、去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯的峰面積和濃度均呈線性關(guān)系，相關(guān)性系數(shù)均＞0.999，見表1。

表1 8種成分同時檢測的標準曲線情況

2.2 加樣回收率8種成分的加樣回收率均＞98.0%，見表2。

2.3 日間精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性8種成分的日間精密度變異系數(shù)、穩(wěn)定性、重復(fù)率變異系數(shù)均＜3.0%，見表3。

表2 8種成分的加樣回收率

表3 8種成分的日間精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性變異系數(shù)（%）

3 討論

目前，雖然隨著中藥現(xiàn)代化技術(shù)的發(fā)展，對于中藥材有效成分的研究更為科學(xué)，很多臨床應(yīng)用較廣的中藥材均通過實驗室的分離、純化得到了很多單體物質(zhì)，對單體物質(zhì)逐一進行藥理實驗為臨床中藥材的應(yīng)用提供了科學(xué)的依據(jù)[8，9]。但是，目前采用中藥材分離出來的單體單獨應(yīng)用于臨床治療的案例相當(dāng)少。絕大部分均采用有效部位進行制劑研究并加以臨床應(yīng)用。我們常見的中成藥，少部分采用直接原生藥材入藥制成顆粒劑或者片劑，大部分是通過提取技術(shù)，采用不同極性的溶劑提取出性質(zhì)不同的一組物質(zhì)作為原料進行進一步的制劑成形制成中成藥[10，11]。因此，研究中藥材有效部位質(zhì)量控制仍然是目前對中藥材現(xiàn)代化研究的主要手段[12，13]。根據(jù)中藥材成分復(fù)雜，檢測難度大的特點，高效液相色譜分析技術(shù)目前仍然是研究中藥材質(zhì)量最為重要的方法。通過對樣品的前期分離純化，得到不同提取部位的供試品后，采用液相色譜的分離能力，將多種成分按照極性由弱到強的順序進行洗脫，逐一采用光譜分析，得到相應(yīng)成分的含量水平[14，15]。

中藥材有效部位一般按照所用的提取溶劑分類，水、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇是中藥材提取最為常用的溶劑。通過這一系列溶劑組合，可將中藥材中大部分有效成分加以分離，而去掉中藥材種大量的鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類等臨床通常認為的無效物質(zhì)。提取方案是根據(jù)藥材本身的部位、已有文獻對有效成分的藥理實驗結(jié)果等進行設(shè)計[16，17]。墨旱蓮是臨床較常見的補益類中藥材，其在滋補肝腎方面的作用較為顯著。隨著人們對自身身體健康的重視，近年來補益類中藥得到廣泛的關(guān)注。臨床對墨旱蓮的研究工作也較多。墨旱蓮目前經(jīng)分體純化得到的單體成分超過九十種。通過現(xiàn)代藥理實驗證實，墨旱蓮具有多種藥理活性。體現(xiàn)了墨旱蓮的藥用價值。部分文獻通過對墨旱蓮不同溶劑提取的有效部位進行藥理分析，獲得了價值較大的藥理活性。因此，對墨旱蓮按照不同有效部分進行質(zhì)量控制對于配合不同有效部分藥理實驗成為了必然。本文在分析多種文獻的基礎(chǔ)上[18，19]，對墨旱蓮正丁醇提取物有效部位的活性成分進行質(zhì)量分析，擬通過HPLC方法通過一次樣品處理、進樣、檢測，對8種活性成分進行含量檢測，為墨旱蓮的正丁醇提取物的臨床應(yīng)用提供參考。

結(jié)果顯示，采用梯度洗脫的方式，采用乙腈：0.5%乙酸和甲醇：0.4%的磷酸溶液兩種流動相，按照流動相極性由弱變強的順序，逐步調(diào)整，能洗脫出8種活性成分，并與210nmUV光處檢測，墨旱蓮正丁醇有效部位的8種活性成分，的峰面積和濃度均呈線性關(guān)系，相關(guān)性系數(shù)均＞0.999，8種成分的加樣回收率均＞98.0%，8種成分的日間精密度變異系數(shù)、穩(wěn)定性、重復(fù)率變異系數(shù)均＜3.0%。說明該方法同時檢測墨旱蓮正丁醇提取物種8種活性成分是可行的。但限于時間和實驗條件的限制，其在對不同來源的墨旱蓮藥材的測定方面的工作尚未開展，這對于該方法的適用范圍非常重要，應(yīng)是該方法下一步應(yīng)重點進行研究確認的工作。

綜上所述，HPLC方法同時測定墨旱蓮有效部位的8種活性成分具有較好的穩(wěn)定性，可重復(fù)性好，回收率高。為墨旱蓮有效部位活性成分的質(zhì)量控制提供了量化手段，是適合墨旱蓮臨床主要以有效部位作為臨床應(yīng)用的特性，具有較高的應(yīng)用價值。

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Simultaneous Determination of the Active Contents in N-butanol Effective Fraction of Herba Ecliptae by HPLC

KONG Yanling.Department of Pharmaceutics，Second Traoltional Chinese Medicine Hospital of Zhumadian City，Zhumadian Henan 463000，China.

Objective To establish an HPLC method for the simultaneous quantitation of the active contents in the n-butanol effective fraction of Herba Eclipta components would provide references for the quality control.Methods According to the clinical researches about the pharmacological screening of the active contents in n-butanol effective fraction of Herba Ecliptae，determined the main active components(including ginsenoside A，oleanolic acid，apigenin，luteolin，alpha terthienyl，(3 butene alkyne group 2，2 BU)one or two bithiophene，W.parthenolide and demethylwedelolactone).Commercially available and identified Eclipta was extracted with petroleum ether，ethyl acetate and normal butanol successively to get n-butanol effective fraction，the main active components in which were separated and detected by high performance liquid chromatography(HPLC)simultaneously.Mobile phase composition：elution procedure.Using the standard solutions of the eight components，the linearity，recovery，inter day precision，reproducibility and stability of the HPLC method for simultaneous determination of the 8 components were analyzed，and the value of the method was synthetically assessed.Results Using the above detection condition，the results showed that the relationship between peak area and concentration of eight active components，including ginsenoside A，oleanolic acid，apigenin，luteolin，alpha terthienyl，(3 butene alkyne Bu Ji)2，peak area and concentration of 2 one or two bithiophene，wedelolactone and demethylwedelolactone were linear dependence，and the correlation coefficients were all greater than 0.999.The recoveries of the eight components were all over 98%，and the variation coefficient of the precision，stability and repetition rate were all less than 3%.Conclusion The HPLC method for the simultaneous determination of the eight active components in the n-butanol effective fraction of Eclipta had well stability and repeatability and high recovery rate.We provided and validated a quantitative method for the quality control of the active ingredients in the effective fraction of Eclipta，which was suitable for clinical characteristics of applying clinical main effective contents in Eclipta and had higher application value.

∶HPLC；Herba Ecliptae；Effective part；Active components；Quality control

R284.2

A

1674-1129(2017)04-0475-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.006

2017-03-06；

2017-05-08)

孔燕凌，女，1970年生，本科，副主任中藥師。