王 巖，代群威，趙玉連

西南科技大學 環(huán)境與資源學院，四川 綿陽 621010

土壤耐鍶細菌的篩選及其吸附效果

王 巖，代群威*，趙玉連

西南科技大學 環(huán)境與資源學院，四川 綿陽 621010

為了從土壤中篩選出具有耐鍶性的細菌，利用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基采用平板涂布的方法從土壤中分離出了12株菌株，通過其對Sr2+的吸附效果對比分析，篩選出了其中4株對Sr2+具有較好吸附效果的細菌進行了馴化，并對馴化前、后細菌生長速率(υA)及對Sr2+的吸附效果進行了分析。結果顯示：在含Sr2+培養(yǎng)液中馴化后的細菌生長能力有明顯提高，生長速率υA的峰值υA，max的位置由馴化前的1.0 d提前到0.5 d；同時馴化后的細菌對Sr2+吸附效率均有所提高，篩選出的4株細菌在30 ℃、轉(zhuǎn)速120 r/min、pH=7、培養(yǎng)時間5.0 d的條件下對Sr2+的最佳吸附效率均可達到90%以上。

耐鍶性細菌；篩選；馴化；吸附Sr2+

隨著工業(yè)與科學技術的發(fā)展和創(chuàng)新，核技術越來越廣泛地應用于工農(nóng)業(yè)、交通運輸、軍事能源和醫(yī)療衛(wèi)生等方面[1-2]，但核能的開發(fā)利用在給人類帶來巨大經(jīng)濟社會效益的同時，不可避免的會產(chǎn)生放射性廢氣、廢液，對環(huán)境造成一定的危害[3-4]。放射性污染物有致畸、致癌、致突變的作用，可以通過食物鏈富集到人體，對人體健康造成極大危害[5]。土壤放射性污染物質(zhì)主要來自天然放射性污染、人工放射性核素污染和技術激活型污染[6]，其中鍶作為常見的污染物，主要來源于核爆炸沉降物和核工業(yè)廢物的排放，鍶是水溶性金屬核素，其半衰期長且與Ca2+性質(zhì)相似，攝入體內(nèi)的鍶可以置換Ca2+沉淀在骨骼上，可以誘導白血病和多種腫瘤疾病的發(fā)生，對人體健康造成嚴重威脅[1,7]。

目前受到放射性污染的土壤，可以根據(jù)放射性核素濃度的強弱、環(huán)境化學特性、沉積特性以及放射性半衰期的長短等特點，采用不同的方法去除其中的放射性核素[8]。主要采用的修復方法有螯合劑浸取、反滲透超濾技術、離子交換技術和土壤清洗等，但是這些方法成本較高，與傳統(tǒng)的物理和化學方法相比，微生物修復及聯(lián)合修復法具有成本低、效果好、無二次污染等優(yōu)點，適用于大面積土壤的修復，是真正意義上的“綠色修復技術”[9-10]。已有研究表明細菌、酵母菌、真菌和藻類對Sr2+均有較好的吸附效果，Chen等[11]利用釀酒酵母菌對Sr2+進行吸附實驗，并對其吸附效果進行Langmuir擬合，結果顯示其最大吸附量為0.091 mmol/g；Chakraborty等[12]利用高碘酸鈉溶液對Ocimum basilicum進行修飾處理后，其對90Sr的最大吸附量可以達到247 mg/g。生物修復主要依靠細菌、真菌甚至高等植物以及細胞游離酶的自然代謝過程降解去除環(huán)境中的污染物，微生物吸附放射性核素后可以通過交換吸收作用將放射性核素固定在微生物體內(nèi)；或可誘導碳酸/磷酸/硫酸鹽等礦物沉積，生成無機礦物使其由活化態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定態(tài)；也可通過微生物的作用促進放射性核素自土壤中溶出至液相，這樣達標的土壤就可原地回填，含有較高濃度放射性物質(zhì)的液相則可轉(zhuǎn)至其它生物反應器[13-15]。放射性核素與微生物相互作用研究已取得了一些重要的進展，但是尋找和篩選對目標放射性核素有抗性并具有較強吸附能力的微生物仍是一個熱點問題[16-18]。

本研究直接從自然界的土壤中分離菌株、篩選出對Sr2+有較好吸附效果的細菌對其進行馴化，并對Sr2+的吸附效果進行研究，能為放射性核素離子以及重金屬離子在土壤中遷移過程受微生物因素影響機制提供理論依據(jù)，對土壤放射性核素污染的原位生物修復技術的發(fā)展和實際應用也具有一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土壤樣品 土壤選用四川省綿陽市北部地區(qū)的草坪土壤，該土壤是四川盆地具有代表性的紫色土壤，采樣深度為 0～20 cm。按照五點法取樣，采樣后各土壤樣品混合。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 細菌分離用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基:牛肉膏(北京奧博星生物技術有限責任公司)3.0 g，蛋白胨(成都長壽生物制劑有限公司)5.0 g，NaCl(成都金山化學試劑有限公司)5.0 g，瓊脂(成都市科龍化工試劑廠)15.0～20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0～7.6。滅菌條件為：0.1 MPa，121 ℃下滅菌30 min。

1.1.3 主要儀器 AA700型原子吸收光譜儀，美國AAS公司；SHY-2進口大型振蕩器，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；TGL-16C型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠制造；UV-1600型分光光度計，上海美譜達儀器公司；BSA224S型分析天平(精度萬分之一)，德國賽多利斯公司；DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗步驟

1.2.1 細菌的分離 將所采土壤樣品10 g左右置于裝有50 mL無菌生理鹽水的250 mL錐形瓶中，150 r/min、30 ℃下震蕩1.0 h，將土壤中的微生物洗脫出來，靜置30 min備用。用接種針取一小部分上層清液用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板劃線，并對土壤樣品液體梯度稀釋后進行平板涂布，根據(jù)菌落情況利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)2.0 d，獲得較純細菌菌株后；同時制備斜面在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 耐鍶細菌的篩選與馴化 將含有100 mg/L Sr2+的液體培養(yǎng)基，分裝于50 mL錐形瓶中，每瓶裝25 mL。取0.2 mL菌液接種于對應編號錐形瓶中，在120 r/min、30 ℃的條件下震蕩培養(yǎng)5.0 d。各取1.0 mL菌液，10 000 r/min下離心10 min，取0.5 mL上清液稀釋后作為樣品測試其中Sr2+濃度。根據(jù)Sr2+測試結果，篩選出實驗條件下對Sr2+具有較好吸附效果的細菌菌株。在已篩選的對Sr2+具有較好吸附效果的土壤細菌的基礎上，將其分別接種于含100 mg/L的Sr2+液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、120 r/min下培養(yǎng)5.0 d。取出后轉(zhuǎn)種于同樣濃度含Sr2+液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，反復脅迫誘導馴化3個月左右。

1.2.3 馴化前、后細菌生長速率分析 將細菌的生長速率定義為：單位時間(1.0 h)內(nèi)菌液吸光度(A)的凈增加值。根據(jù)各菌株對Sr2+吸附培養(yǎng)過程中的A540 nm變化情況，獲得某個時間區(qū)間Δt內(nèi)的ΔA值，可利用式(1)計算獲得各菌株不同生長時期相應的生長速率。

(1)

其中，υA，實驗菌株的生長速率；t1、t2，實驗菌株在含Sr2+培養(yǎng)液中生長時間；At1、At2，實驗菌株在t1、t2時刻對應吸光度值。

1.2.4 馴化后的細菌對Sr2+吸附效果分析 配制含有300 mg/L Sr2+的液體培養(yǎng)基，將馴化好的細菌菌液取0.5 mL接種于對應編號錐形瓶中，在30 ℃、120 r/min、pH=7的條件下震蕩培養(yǎng)5.0 d后取1.0 mL菌液，10 000 r/min下離心10 min，取0.5 mL上清液稀釋后，作為樣品用原子吸收法測試其中Sr2+濃度，根據(jù)公式(2)由吸附前、后Sr2+濃度計算吸附效率η:

(2)

式中：C0、Ct分別為吸附前、后Sr2+濃度。

1.2.5 細菌形態(tài)分析 采用革蘭氏染色法對細菌進行染色：取一張潔凈載玻片，在載玻片上放置一滴生理鹽水，用無菌操作方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混合，涂成1 cm×1 cm大小的區(qū)域。待涂片自然干燥后在酒精燈火焰上緩慢烘干，最后通過火焰烘干3次，以使細菌固定在玻片之上；在制作好的細菌涂片上滴加少許結晶紫染色液，染色1 min后水洗；在制作好的細菌涂片上滴加少許盧戈碘液，染色1 min后水洗；在制作好的細菌涂片上滴加番紅染液后進行水洗，待自然干燥后以作鏡檢。

2 結果與討論

2.1 細菌菌株的篩選

將土壤液體平板涂布后經(jīng)過分離，最后確定了生長較好的12株細菌進行耐鍶菌株的篩選，將以上菌株分別接種到含有Sr2+培養(yǎng)基中進行吸附培養(yǎng)分析，對比各株土壤分離菌在生長過程中對Sr2+的吸附效率，其結果示于圖1。由圖1可以看出，12株細菌對Sr2+的吸附效率達到80%以上的為4#、7#、8#和11#菌株，其吸附效率分別為87.61%、89.27%、90.91%和90.25%，其余各株細菌對Sr2+的吸附效率集中在49%～60%，由此確定選擇4#、7#、8#和11#菌株作為馴化菌株。

r=120 r/min，θ=30 ℃，t=5.0 d圖1 土壤細菌對Sr2+的吸附效果Fig.1 Adsorption effect of soil bacteria on Sr2+

2.2 細菌菌株馴化前、后生長情況

馴化前、后各菌株的生長過程變化情況示于圖2。由圖2可以看出，馴化后各株細菌在含Sr2+培養(yǎng)液中的生長能力有明顯提高，特別是在各菌株對Sr2+吸附過程中出現(xiàn)明顯拐點的2.0～3.0 d時間范圍內(nèi)，馴化后的各株細菌對應的吸光度均比馴化前有明顯的提高。如：4#細菌在2.0 d時未馴化的吸光度為1.042，而馴化后變?yōu)?.314；7#細菌在2.5 d時未馴化的吸光度為1.236，而馴化后變?yōu)?.610；8#細菌在3.0 d時未馴化的吸光度為1.204，而馴化后變?yōu)?.470；11#細菌在3.0 d時未馴化的吸光度為1.484，而馴化后變?yōu)?.607。由此可以說明經(jīng)過含Sr2+培養(yǎng)液的馴化后各菌株的適應能力增強，同期生長量提高。

2.3 細菌菌株馴化前、后生長速率分析

r=120 r/min，θ=30 ℃，t=5.0 d□——未馴化，○——馴化后(a)——4#，(b) ——7#，(c) ——8#，(d) ——11#圖2 馴化前、后細菌的生長曲線Fig.2 Bacterial growth curves before and after domestication

馴化前、后的各細菌菌株的υA分析結果示于圖3。由圖3所示，對于馴化后的細菌其生長速率υA的峰值υA，max的位置由馴化前的1.0 d提前到0.5 d時出現(xiàn)，整體提前了0.5 d。這是由于細菌的生長周期一般為1.0 d左右，在馴化前，由于液體培養(yǎng)基中含有Sr2+對細菌有一定抑制生長的負面作用。經(jīng)過長時間在含Sr2+環(huán)境下的多代反復馴化處理，馴化后的各細菌的穩(wěn)定生長期提前到了0.5 d附近。這表明各細菌菌株在外界Sr2+環(huán)境脅迫下，逐漸適應了該離子液相環(huán)境，能夠基本恢復到原有的生長狀態(tài)，菌量的提高也相應增加了各菌株對Sr2+的吸附效率。圖3中除了υA,max的最大峰外，馴化前、后生長速率曲線中都還有幾個其他峰出現(xiàn)，且同菌株各峰間隔基本為1.0 d，說明各株細菌的生長周期為1.0 d。

r=120 r/min，θ=30 ℃，t=5.0 d□——4#， ○——7#，△——8#，▽——11#(a)——馴化前，(b)——馴化后圖3 馴化前、后細菌生長速率分析Fig.3 Bacterial growth rate before and after domestication

2.4 馴化前、后對Sr2+的吸附效果分析

馴化前、后各細菌菌株對Sr2+的吸附情況示于圖4。從圖4可以看出，馴化后各菌株對Sr2+的吸附能力明顯提高，如：馴化后4#細菌達到平衡的時間為3.5 d，此時吸附效率為93.65%，而馴化前僅為66.38%；馴化后7#細菌達到平衡的時間為3 d，此時吸附效率為94.40%，而馴化前僅為47.37%；馴化后8#細菌達到平衡的時間為3 d，此時吸附效率為93.65%，而馴化前僅為48.25%；馴化后11#細菌達到平衡的時間為3 d，此時吸附效率為95.26%，而馴化前僅為63.88%。從圖4還可以看出，盡管吸附開始的階段，馴化后各菌株的吸附能力并未具有明顯優(yōu)勢，但在2.0 d的時候有了很大提高，就其整體吸附效果來講，馴化后各細菌的吸附效率都有所提高，而且吸附平衡點明顯提前。馴化后，不同細菌對Sr2+的吸附效率不近相同的原因可能是不同的細菌具有自己獨特的生長環(huán)境，不同的生長條件下會影響其生物活性，因此在相同的吸附條件下顯現(xiàn)不同的吸附效果；而馴化后細菌對Sr2+吸附效率都有所提高，原因可能是由于經(jīng)過實驗過程中在含Sr2+液相環(huán)境下的脅迫誘導馴化處理，菌體對Sr2+抗性有一定減弱，使得 Sr2+與菌體基團結合，進入活性點位的難度降低，也一定程度上提高了各菌株對Sr2+的吸附速率。

r=120 r/min，θ=30 ℃，t=5.0 d□——未馴化，○——馴化后(a)——4#，(b) ——7#，(c) ——8#，(d) ——11#圖4 馴化前、后細菌對Sr2+的吸附效果Fig.4 Adsorption effect of bacteria on Sr2+ before and after domestication

2.5 細菌形態(tài)分析

經(jīng)過顯微鏡觀察染色后各株細菌的形態(tài)示于圖5。由圖5可知，所篩選的4株耐鍶細菌均為桿狀結構。7#、8#為長桿狀結構，4#、11#為短桿狀結構，8#、11#菌株形態(tài)大小較4#、7#菌株更加均勻而且分布的更加密集，4株細菌具體的菌屬下一步實驗將會繼續(xù)研究確定。

3 結 論

(1) 從土壤中經(jīng)過分離、純化及篩選出了4株對鍶有較好吸附效果的細菌：4#、7#、8#、11#；

(2) 在外界Sr2+環(huán)境脅迫下，細菌逐漸適應了液相環(huán)境，其生長能力有明顯提高，生長速率υA的峰值υA，max的位置由馴化前的1.0 d提前到0.5 d；

(3) 馴化后的細菌對Sr2+吸附效率均有所提高，篩選出4株細菌在30 ℃、120 r/min、pH=7、培養(yǎng)時間5.0 d條件下的最佳吸附效率均達到90%以上。

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(a)——4#，(b) ——7#，(c) ——8#，(d) ——11#圖5 細菌顯微照片(×1 600)Fig.5 Bacterial micrograph (×1 600)

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Screening and Adsorption Effect Analysis of Strontium Tolerant Bacteria in Soil

WANG Yan, DAI Qun-wei*, ZHAO Yu-lian

School of Environment and Resource, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China

In order to screen bacteria with strontium tolerance from soil, using flat coating method in beef peptone culture medium to isolate 12 strains from soil. Through the comparative analysis of the Sr2+adsorption effect, 4 strains of bacteria which have good adsorption effect on Sr2+to domestication was selected, and the bacterial growth rate(υA) before and after acclimation as well as the Sr2+adsorption effect was analysed. The results show that the growth ability of acclimated bacteria in the culture medium containing Sr2+is obviously improved, the peak position(υA,max) of growth rate (υA) increases from 1.0 d to 0.5 d. At the same time, the adsorption efficiency of Sr2+is improved after the domestication bacteria. The best adsorption efficiency of screened 4 strains of bacteria on Sr2+can reach more than 90% in the condition of temperature is 30 ℃, rotational speed is 120 r/min, pH is 7 and incubation time is 5 d.

bacteria resistant to strontium; screening; domestication; adsorption on Sr2+

2017-03-31；

2017-05-15

國家自然科學基金重點項目(41130746)；四川省科技廳應用基礎研究重點項目(2016JY0213)

王 巖(1990—)，男，吉林長春人，碩士研究生，環(huán)境科學與工程專業(yè)，從事新生污染的安全與調(diào)控研究，E-mail: 741372147@qq.com

*通信聯(lián)系人：代群威(1978—)，男，河南漯河人，教授，從事新生污染的安全與調(diào)控研究，E-mail: qw_dai@163.com

X591

A

0253-9950(2017)04-0284-06

10.7538/hhx.2017.39.04.0284