李宛靜，徐曉娟△，黃映紅，鄧蒂斯，雒芙蓉，張 純

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610075)

【實驗研究】

補(bǔ)腎化痰方調(diào)控大鼠卵巢GC中APN信號通路機(jī)制的研究

李宛靜1，徐曉娟1△，黃映紅2，鄧蒂斯1，雒芙蓉1，張 純1

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610075)

目的：通過分析補(bǔ)腎化痰方對大鼠顆粒細(xì)胞脂聯(lián)素受體1/2(AdipoR1/2)蛋白表達(dá)水平及下游分子相關(guān)基因表達(dá)的差異，探討該復(fù)方激活卵巢GC中APN信號通路的機(jī)制。方法：采用雌性SD大鼠，體外培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞，Western-blotting測定AdipoR1/2的蛋白表達(dá)量，Real-time PCR測定AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a的mRNA表達(dá)。結(jié)果：與空白組比較，羅格列酮組、中藥中低劑量組大鼠GC的AdipoR1/2含量均明顯上升且差異有統(tǒng)計學(xué)意義；GC中AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a的mRNA表達(dá)量亦有明顯的變化趨勢，與空白組比較，羅格列酮組、中藥中低劑量組的mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：補(bǔ)腎化痰方能激活大鼠GC中APN信號通路的機(jī)制，可能與該方調(diào)節(jié)卵巢生殖激素轉(zhuǎn)化及卵巢局部糖脂代謝相關(guān)。

補(bǔ)腎化痰方；卵巢顆粒細(xì)胞；APN信號通路

補(bǔ)腎化痰方在中醫(yī)婦科臨床治療多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)、卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)、不孕癥(Infertility)等疾病中已經(jīng)取得顯著療效，然其具體機(jī)制尚不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，卵巢顆粒細(xì)胞(granulosa cell, GC)在諸多婦科疑難病種的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色，能影響排卵、黃體生成、女性甾體激素水平及卵巢局部的糖脂代謝水平[1]。本文采用該復(fù)方干預(yù)體外培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞，旨在闡明該方通過激活卵巢GC中APN信號通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)卵巢生殖激素轉(zhuǎn)化及卵巢局部糖脂代謝的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用3～4周齡清潔級雌性SD大鼠，體質(zhì)量約60～70 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供(動物許可證號SCXK(川)2013-24)。

1.2 實驗用藥物及主要試劑

補(bǔ)腎化痰方組成：菟絲子30 g，覆盆子30 g，桑椹子30 g，補(bǔ)骨脂10 g，鹿角霜10 g，紫河車10 g，茯苓20 g，陳皮15 g，車前子15 g，肉蓯蓉15 g等，由成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院實驗室統(tǒng)一制備成14.8 g/ml、7.4 g/ml、3.7 g/ml的水煎液，分別相當(dāng)于成人用藥等效劑量10、5、2.5倍。羅格列酮(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司生產(chǎn)，批號15020009)，F(xiàn)SHR第一抗體(武漢博士德生物工程有限公司，多克隆兔抗鼠，生產(chǎn)批號AD082527)；AdipoR1第一抗體(Santa Cruz Company，多克隆抗體，羊抗鼠)；孕馬血清(PMSG,Solarbio，生產(chǎn)批號20141117)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司)；TRIZOL試劑液(Invitrogen Company)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BIO-RAD；iScriptTMcDNA Synthesis Kit)；熒光定量PCR 所用試劑盒(BIO-RAD；SsoFastTMEvaGreen?Superemix)。

1.3 補(bǔ)腎化痰方含藥血清的制備

取6～7周齡的SD雌鼠50只，體質(zhì)量約180～200 g，隨機(jī)分為中藥高、中、低劑量組、羅格列酮組、空白組各10只。中藥高、中、低劑量組分別給予7.4 g/100 g、3.7 g/100 g、1.85 g/100 g的補(bǔ)腎化痰方水煎液，羅格列酮組按成人劑量的10倍給予羅格列酮0.08 mg/100 g，空白組大鼠給予等體積生理鹽水。各組均灌胃2次/d，連續(xù)3 d后禁食12 h，于第4天一次性給予全天劑量，1 h后股動脈取血。將各組血液于4℃下靜置4 h，2000 r/min離心15 min，取上清抽濾除菌同組混勻，56℃條件下滅活30 min并分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大鼠GC的分離、培養(yǎng)及鑒定

參照Lovekamp[4]等方法，取雌性SD大鼠30只，皮下注射PMSG 40 IU，48 h 后分離GC，將GC加入含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中制備單細(xì)胞懸液，按3×105個/ml接種于24孔板，并將細(xì)胞分為空白血清組、中藥高、中、低劑量組、羅格列酮組，每組10孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)3 d后棄培養(yǎng)液，加入含空白血清或含藥血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h,處理方法如下。

空白組每孔加入含20%空白血清的DMEM培養(yǎng)液1 ml； 中藥高劑量組每孔加入含20%高劑量補(bǔ)腎化痰方血清的DMEM培養(yǎng)液1 ml； 中藥中劑量組每孔加入含20%中劑量補(bǔ)腎化痰方血清的DMEM培養(yǎng)液1 ml； 中藥低劑量組每孔加入含20%低劑量補(bǔ)腎化痰方血清的DMEM培養(yǎng)液1 ml； 羅格列酮組每孔加入含20%羅格列酮血清的DMEM培養(yǎng)液1 ml。

GC的鑒定：將GC以2×106/ml 的密度接種于已預(yù)置好小蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2及完全飽和濕度條件下培養(yǎng)制成細(xì)胞爬片。當(dāng)細(xì)胞生長至70%融合時取出玻片，行細(xì)胞免疫化學(xué)染色。

1.5 Western Blotting檢測GC的AdipoR1/2表達(dá)

提取各組GC的總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度，Western blotting檢測 GC 的AdipoR1表達(dá)水平，一抗1∶200稀釋，二抗1∶1000稀釋。掃描PVDF膜上各條帶，記錄各條帶的平均光密度值，用以表示GC細(xì)胞膜AdipoR的相對含量，比較各組GC細(xì)胞膜AdipoR1表達(dá)的差異。

1.6 Realtime PCR檢測GC中AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19amRNA的表達(dá)

表1顯示，使用Invitrogen TRIZOL試劑提取細(xì)胞總RNA，用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳，然后用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察RNA的完整性。所得RNA采用BIO-RAD公司的iScriptTMcDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計引物后對PCR進(jìn)行擴(kuò)增。熒光定量PCR 所用試劑盒為BIO-RAD 公司的SsoFastTMEvaGreen ?Superemix，PCR反應(yīng)在Bio-Rad IQ5 PCR儀上進(jìn)行，每個樣品均重復(fù)3次以避免加樣誤差，實驗數(shù)據(jù)利用iQ5-Cycler進(jìn)行分析，分析方法為ΔΔCt法。根據(jù)NCBI公布的基因序列進(jìn)行引物設(shè)計。

表1 檢測基因的引物序列表

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠卵巢組織中卵泡GC鑒定

圖1顯示，采用免疫組織化學(xué)染色法對取材正確性進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示所培養(yǎng)的細(xì)胞為大鼠卵巢組織中卵泡顆粒細(xì)胞。

圖1 大鼠卵巢組織中卵泡顆粒細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果(100×)注：GC取材于大鼠卵巢組織中的卵泡，箭頭標(biāo)示處為卵巢顆粒細(xì)胞

2.2 補(bǔ)腎化痰方對GC的AdipoR1/2表達(dá)的影響

圖2 大鼠卵巢組織中卵泡顆粒細(xì)胞AdipoR1、AdipoR2蛋白的Western blotting檢測電泳條帶注：Western blotting法檢測采用雙盲法，每個蛋白組別順序不同。K.空白血清組；D.中藥低劑量組；G.中藥高劑量組；L.羅格列酮組；Z.中藥中劑量組

圖2表3顯示，本研究采用Western blotting觀察補(bǔ)腎化痰方調(diào)控GC細(xì)胞膜上AdipoR1、AdipoR2的表達(dá)水平，各組細(xì)胞的總蛋白質(zhì)濃度分別為空白血清組2.52 mg/ml，中藥中劑量組2.53 mg/ml，中藥低劑量組2.14 mg/ml，中藥中劑量組2.48 mg/ml，羅格列酮組3.12 mg/ml。結(jié)果顯示，GC細(xì)胞膜表面均存在AdipoR1、AdipoR2的特異性表達(dá)；與空白血清組比較，中藥低劑量組、中劑量組和羅格列酮組的表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中中藥中劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

組 別樣品孔AdipoR1表達(dá)量AdipoR2表達(dá)量空白組31.02±0.011.07±0.12羅格列酮組33.65±0.07*4.44±0.09*中藥低劑量組310.62±0.10**3.88±0.06*中藥中劑量組314.05±0.15**5.23±0.09**中藥高劑量組32.58±0.17*3.33±0.11*

注：與空白組比較:*P<0.05，**P<0.01

2.3 補(bǔ)腎化痰方對GC的AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a表達(dá)的影響

表3顯示，本研究采用Realtime-PCR法測定卵巢顆粒細(xì)胞AMPK、Cyp19a、PPAR-α/β/γ的表達(dá)有明顯的變化趨勢。與空白組比較，羅格列酮組及中藥中、低劑量組的表達(dá)量均明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

組 別例數(shù)AMPKPPAR-αPPAR-βPPAR-γCyp19a空白組32.00±0.113.06±0.241.52±0.274.03±0.272.07±0.24羅格列酮組34.00±0.45*7.47±0.20*4.58±0.41*9.93±0.44**4.97±0.41*中藥低劑量組34.19±0.17*6.29±0.26*3.01±0.18*7.97±0.28*4.43±0.24*中藥中劑量組35.04±0.41**8.95±0.48**5.27±0.22**9.22±0.26**6.05±0.23**中藥高劑量組33.77±1.06*5.38±0.26*2.69±0.21*4.86±0.244.02±0.25*

注：與空白組比較：*P<0.05；**P<0.01

3 討論

本實驗基于中醫(yī)理論及導(dǎo)師徐曉娟教授長期臨床實踐，選用補(bǔ)腎經(jīng)典復(fù)方五子衍宗丸及痰濕證常用方蒼附導(dǎo)痰湯臨證加減，去五味子選用更精于補(bǔ)益精血的桑椹子。全方補(bǔ)腎陽益精血、補(bǔ)中寓行、燥濕健脾、行氣解郁化痰，兩方合用共奏補(bǔ)腎健脾化痰、調(diào)理沖任之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，補(bǔ)腎化痰類中藥具有類雌激素樣作用，可作用于下丘腦調(diào)節(jié)促性腺激素分泌[2]，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖[3]，增加卵泡對卵泡刺激素的反應(yīng)性，引起下丘腦-垂體反饋，促進(jìn)初級卵泡向優(yōu)勢卵泡發(fā)育，減少痰濕體質(zhì)患者體內(nèi)脂肪積聚，改善血中載脂蛋白含量和血液的濃黏凝聚狀態(tài)。臨床及實驗研究均證實[4]，補(bǔ)腎化痰復(fù)方可以調(diào)節(jié)患者體內(nèi)雌激素和雄激素水平而促排卵，并能改善糖脂代謝功能。

已有研究證實[5]，豬卵巢中脂聯(lián)素與雌激素的合成有關(guān)。有研究已證實，GC通過影響促性腺激素對卵母細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，能構(gòu)建有利于卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的分子微環(huán)境[6]。因此，APN/AMPK信號通路的激活，能夠正向調(diào)節(jié)卵巢GC生殖激素的轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)卵泡的發(fā)育。有研究證實，CYP19a基因是編碼雌激素生成的關(guān)鍵酶——細(xì)胞色素P450芳香化酶，是雌激素合成最后一步的限速酶，其表達(dá)與雌激素生成相關(guān)[7]。據(jù)此推測此為該方改善PCOS、卵巢早衰、不孕癥等疾病的機(jī)制。有研究證實[8-9]，該條通路的激活能夠促進(jìn)脂肪酸的燃燒與能量的消耗；而PPAR-γ是與肥胖、胰島素抵抗密切相關(guān)的基因，其激動劑羅格利酮已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床治療2型糖尿病及PCOS伴發(fā)胰島素抵抗的患者。有研究表明，脂聯(lián)素及其mRNA表達(dá)在肥胖者表達(dá)量下降，而其表達(dá)水平隨體質(zhì)量減輕又再次增加[10]。亦有研究顯示，血清及卵泡液脂聯(lián)素含量與BMI呈負(fù)相關(guān)；在肥胖型PCOS痰濕證中，血清及卵泡液的APN水平及AdipoR1/2表達(dá)水平均顯著性下降。

根據(jù)本實驗結(jié)果提示，補(bǔ)腎化痰方能活化AdipoR1/2，上調(diào)CYP19a的表達(dá)，促進(jìn)雄烯二酮向雌激素轉(zhuǎn)化，而機(jī)體維持正常的雌激素水平是卵泡發(fā)育及子宮內(nèi)膜發(fā)育的必備條件，因此該法能夠有效改善卵泡發(fā)育障礙，而臨床能夠有效治療PCOS、POF、Infertility等疾病，其機(jī)制可能與此有關(guān)。另外根據(jù)實驗結(jié)果提示，該方能活化AdipoR，并能上調(diào)PPARα/β/γ的表達(dá)，改善因女性生殖內(nèi)分泌紊亂引起的卵巢局部糖脂代謝紊亂，為卵母細(xì)胞發(fā)育為優(yōu)勢卵泡提供良好的分子微環(huán)境。

綜上所述，本項研究結(jié)果與課題組整體實驗采用肥胖型PCOS大鼠觀察補(bǔ)腎化痰方對GC中APN信號通路的影響及其對糖代謝、卵泡發(fā)育的調(diào)控作用一致，故可推測補(bǔ)腎化痰方能通過調(diào)控APN/AMPK信號通路傳導(dǎo)正向調(diào)節(jié)卵巢激素轉(zhuǎn)化及卵巢糖脂代謝。

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Study on the Mechanism of APN Signaling Pathway Regulating GC in Ovary of Rats by Tonifying Kidney and Resolving Phlegm Prescription

LI Wan-jing1, XU Xiao-juan1△, HUANG Ying-hong2, Deng Di-si1, LUO Fu-rong1, ZHANG Chun1

(1.ClinicalmedicineschoolofChengduUniversityofTCM,Chengdu610075，China; 2.BasicmedcineschoolofChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China)

Objective: By analyzing the protein expression levels of adiponectin receptor1/2(AdipoR1/2) and the gene expression differences related downstream molecules, in order to explore the mechanism of activation the APN signal pathway in rat ovarian granulosa cells(GC) by the Tonifying Kidney and Resolving Phlegm(TKRP) method.Methods: Selected female SD rats, cultured rat ovarian GC in vitro, measured the protein levels of AdipoR1/2 by Western-blotting and the mRNA expression of AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a by Real-time PCR. Results: Compared with the control group,AdipoR1/2 expression of rosiglitazone and middle、low dose group of the TKRP has up to a higher level, which has statistical significance;the mRNA expression of AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a in middle、low dose group of the TKRP was also significantly higher than the control group.Conclusion: The TKRP can activate the APN signal pathway in rat ovarian GC, it may be associated with the TKRP regulating reproductive hormone conversion and glycolipid metabolism in ovary.

Tonifying Kidney and Resolving Phlegm Recipe; Ovarian granulosa cells; APN signal pathway

國家自然科學(xué)基金資助項目(81470199)-經(jīng)APN信號通路探討補(bǔ)腎化痰法調(diào)控肥胖型PCOS卵泡發(fā)育機(jī)制研究；四川省教育廳基礎(chǔ)項目研究(142A0315)-以APN信號途徑為靶點研究補(bǔ)腎化痰法調(diào)控肥胖型PCOS雌鼠GC增殖分化機(jī)制

李宛靜(1990-)，女，四川華鎣人，醫(yī)學(xué)碩士，從事中西醫(yī)對肥胖多囊卵巢綜合征發(fā)病機(jī)制研究。

△通訊作者：徐曉娟(1969-)，女，江蘇鎮(zhèn)江人，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事補(bǔ)腎中藥對女性生殖內(nèi)分泌調(diào)控研究，Tel：13980971928，E-mail: 847956379@qq.com。

R285.5

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1006-3250(2017)05-0642-03

2016-11-09