梁 明，張 婷，鄭 俠，趙宏艷，潘靜華，李岳澤，鞠大宏，劉梅潔 △

(1. 無限極(中國)有限公司，廣州 510665; 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；3. 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700)

【實驗研究】

核桃酶解提取物對大鼠記憶力的影響

梁 明1，張 婷1，鄭 俠1，趙宏艷2,3，潘靜華2,3，李岳澤2，鞠大宏2,3，劉梅潔2,3△

(1. 無限極(中國)有限公司，廣州 510665; 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；3. 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700)

目的：探討核桃酶解提取物對老年大鼠記憶力衰退的作用及其機理。方法：將15月齡SD雌性大鼠按隨機數(shù)字表法分為LN組、 LN-HTMJ低、高劑量組3組各10只。LN-HTMJ低、高劑量組分別灌胃給予 0.071 g/kg體質(zhì)量和0.142 g/kg體質(zhì)量的核桃酶解提取物。共給藥6個月。在給藥結(jié)束前1個月選用16只2月齡SD雌性大鼠作為QN組，在大鼠處死前9 d進行八臂迷宮實驗。給藥結(jié)束后，取大鼠的外周血漿和血清、左側(cè)大腦以及剝離右側(cè)大腦皮層和海馬，用于各項指標(biāo)檢測。結(jié)果：核桃酶解提取物(0.142 g/kg體質(zhì)量)能明顯延緩21月齡老年大鼠的記憶力衰退。與青年大鼠比較，老年大鼠海馬中尼氏體減少、AchE水平增高以及大腦皮質(zhì)中DA、NE含量降低，同時其外周血漿中ACTH和血清中CORT含量增加，而核桃酶解提取物能在一定程度上使上述指標(biāo)發(fā)生逆轉(zhuǎn)。結(jié)論：核桃酶解提取物對老年大鼠的記憶力衰退具有明顯的延緩作用，能提高老年大鼠大腦皮質(zhì)中DA、NE含量而降低海馬中AchE水平以及外周血中ACTH和CORT含量，是其作用機理之一。

核桃酶解提取物；老年大鼠；記憶衰退

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 采用SPF級SD雌性老年大鼠30只，15月齡，體質(zhì)量(433±60) g；采用SPF級SD青年雌性大鼠8只，2月齡，體質(zhì)量(210±6) g，均由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供(許可證號SCXK-(軍)2012-0004)。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級實驗動物室(實驗動物使用許可證號SYXK-(京)2010-0032)。

1.1.2 藥品 核桃酶解提取物由無限極(中國)有限公司提供(批號為2014-08-21)。臨用前，用純凈水將核桃酶解提取物分別配制成濃度為0.0071 g/ml和0.0142 g/ml的溶液。

1.1.3 主要試劑 甲苯胺藍染色液(批號0513A15)為北京雷根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。大鼠多巴胺(DA)ELISA試劑盒(批號15102703)、大鼠乙酰膽堿酯酶(AchE)ELISA試劑盒(批號15102702)、大鼠去甲腎上腺素(NE)ELISA試劑盒(批號15102704)、大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)ELISA試劑盒(批號15102304)，均為北京科盈美科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 ZS-3000八臂迷宮分析系統(tǒng)：中國北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；Multiskan Mk3酶標(biāo)儀：美國Thermo公司；Tissue-Tek TECTM組織包埋機、Tissue-Tek IVS-410 切片機：日本櫻花公司；DM 6000B正置顯微鏡、Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統(tǒng)：德國，Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 采用Excel軟件，按照隨機數(shù)字表法將老年大鼠隨機分為老年組(LN組)、老年核桃酶解低劑量組(LN-HTMJ低劑量組)和老年核桃酶解高劑量組(LN-HTMJ高劑量組)3組各10只，然后各給藥組開始灌胃給藥。LN-HTMJ低劑量組和高劑量組分別灌胃給予濃度0.0071 g/ml、0.0142 g/ml的核桃酶解提取物溶液，給藥體積均為10 ml/kg體質(zhì)量，給藥劑量分別為 0.071 g/kg體質(zhì)量和0.142 g/kg體質(zhì)量。以上給藥每日1次，連續(xù)6 d，休息1 d后，再連續(xù)給藥6 d，如此給藥6個月。LN組按同法灌胃給予等體積的純凈水。在給藥結(jié)束前1個月，選取8只青年大鼠作為青年組(QN組)。QN組按上述方法也灌胃給予等體積的純凈水。每周大鼠稱重1次，據(jù)此調(diào)整給藥量。在大鼠處死前9 d，進行八臂迷宮實驗，以檢測各組大鼠的記憶能力。在給藥過程中，大鼠LN組和LN-HTMJ低劑量組各死亡2只， LN-HTMJ高劑量組死亡1只。

在末次給藥1.5 h后，將各組大鼠以45 mg/kg 體質(zhì)量劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。沿腹中線打開腹腔，腹主動脈取血，一部分放入促凝管中靜置2 h，3000 r/min離心15 min取血清；另一部分放入抗凝管(事先進行預(yù)冷處理，K2-EDTA 抗凝)中，用冷凍離心機離心3000 r/min，離心15 min取血漿，然后將血清、血漿放入-80℃冰箱中保存待測。將大鼠處死取大鼠全腦，于冰上迅速分離右側(cè)大腦皮層和海馬，稱重后放入EP管中，置于液氮中保存待測。取左側(cè)大腦放入福爾馬林中固定。

1.2.2 指標(biāo)檢測 大鼠記憶力的檢測：參照文獻[1]和[2]的方法，采用八臂迷宮實驗對各組大鼠的記憶力進行檢測。在訓(xùn)練完后第1天開始檢測，每次1只。大鼠進入有食餌的臂，且攝取了食餌為一次正確選擇，否則為錯誤選擇，記錄參數(shù)為錯誤選擇的次數(shù)。錯誤選擇的次數(shù)分為參考記憶錯誤(Reference memory error，RME)、工作記憶錯誤(Working memory error，WME)和總記憶錯誤(Total error，TE)。RME：大鼠進入不放食物臂的次數(shù)；WME：大鼠重新進入放食物臂或第一次進入放食物臂而不攝取食物的次數(shù)；TE：WME與RME之和。

在每天訓(xùn)練以及檢測完后，對各給藥組大鼠灌胃給予相應(yīng)的藥物(給藥濃度及體積同1.2.1)，QN組、LN組則灌胃給予等體積的純凈水。

海馬尼氏體積分光密度(IOD)的檢測：將固定后的左側(cè)大腦組織在視交叉后2 mm處行冠狀切開，取其后3 mm厚的腦組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，用切片機進行冠狀切片，厚度5 μm；尼氏(Nissel)染色(甲苯胺藍法)，光學(xué)樹脂封片。

在20倍物鏡下，沿海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)的順序，取5個連續(xù)不重疊視野，采用Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統(tǒng)，檢測每個視野內(nèi)的尼氏體IOD，取其平均值。

大腦皮質(zhì)中DA、NE以及海馬中AchE水平的檢測：將大腦皮質(zhì)和海馬分別用預(yù)冷的PBS(pH 7.2)于冰浴下快速勻漿靜置10 min，14000×g低溫離心20 min，取上清液-80℃保存待測。

檢測前，從冰箱中取出凍存的上清液室溫下復(fù)溫。采用ELISA法，按照試劑盒所附說明書，用酶標(biāo)儀分別檢測大鼠大腦皮質(zhì)中DA、NE含量以及海馬中AchE的水平。

外周血漿中ACTH和血清中CORT含量的檢測：檢測前，從冰箱中取出凍存的大鼠血漿、血清室溫下復(fù)溫。采用ELISA法，按照試劑盒所附說明書，用酶標(biāo)儀檢測外周血漿中ACTH和血清中CORT的含量。

2 結(jié)果

2.1 核桃酶解提取物對老年大鼠記憶力影響

表1顯示，迷宮實驗結(jié)果顯示，與QN組比較LN組以及各給藥組大鼠的RME、WME和TE均明顯增多。與LN組比較，LN-HTMJ高劑量組的RME、WME和TE均明顯減少，而LN-HTMJ低劑量組的3個指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組老年大鼠RME、WME和TE的變化

注：與QN組比較：*P<0.05，**P<0.01；與LN組比較：△P<0.05，△△P<0.01；LN-HTMJ高劑量組與其低劑量組比較：#P<0.05，##P<0.01(下同)

2.2 核桃酶解提取物對老年大鼠海馬尼氏體IOD以及海馬中AchE水平的影響

2.2.1 核桃酶解提取物對老年大鼠海馬尼氏體IOD的影響 表2圖a-圖f顯示，LN組以及各給藥組大鼠海馬尼氏體IOD皆顯著低于QN組。LN-HTMJ高劑量組的海馬尼氏體IOD皆明顯高于LN組；LN-HTMJ低劑量組的海馬尼氏體IOD與LN組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 各組老年大鼠海馬尼氏體IOD的變化

圖a-f分別為QN組、LN組、LN-NLT低劑量組、LN-NLT高劑量組、LN-HTMJ低劑量組和LN-HTMJ高劑量組大鼠的海馬組織。甲苯胺藍染色(×20)

2.2.2 核桃酶解提取物對老年大鼠海馬AchE水平的影響 圖1顯示，LN組以及各給藥組大鼠海馬中AchE水平與QN組比較均明顯增高。LN-HTMJ高劑量組與LN組比較，AchE水平皆明顯降低，而與LN-HTMJ低劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 各組雌性老年大鼠海馬AchE水平的變化

2.3 核桃酶解提取物對老年大鼠大腦皮質(zhì)DA和NE含量的影響

圖2顯示，LN組以及各給藥組大鼠大腦皮質(zhì)中DA和NE含量皆明顯降低于QN組。LN-HTMJ高劑量組DA和NE含量皆明顯高于LN組，而LN-HTMJ低劑量組DA和NE含量與LN組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 各組雌性老年大鼠大腦皮質(zhì)DA和NE含量的變化

2.4 核桃酶解提取物對老年大鼠外周血漿中ACTH和血清CORT含量的影響

圖3、4顯示，LN組以及各給藥組大鼠外周血漿中ACTH和血清中CORT含量均明顯高于QN組。LN-HTMJ高劑量組ACTH和CORT含量與LN組比較均明顯降低，而LN-HTMJ低劑量組與之比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 各組雌性老年大鼠外周血漿中ACTH含量的變化

圖4 各組雌性老年大鼠外周血清中CORT含量的變化

3 討論

隨著年齡的增長，機體的不斷老化，其學(xué)習(xí)記憶能力也逐漸下降。本研究迷宮實驗結(jié)果顯示， LN組大鼠的RME、WME和TE與QN組比較均明顯增多。參考記憶(Reference memory，RM)代表長期記憶，工作記憶(Working memory，WM)代表短期記憶[1]。這一結(jié)果表明，老年大鼠(SD21月齡)無論是長期記憶能力，還是短期記憶能力均較青年大鼠(SD3月齡)顯著降低。給藥6個月后，迷宮實驗結(jié)果顯示，LN-HTMJ高劑量組大鼠的RME、WME和TE均明顯少于LN組。以上結(jié)果表明，核桃酶解提取物對老年大鼠的記憶力衰退具有明顯的延緩作用。

大鼠邊緣系統(tǒng)-海馬是參與哺乳動物學(xué)習(xí)記憶的主要腦區(qū)之一，若各種原因?qū)е缕鋬?nèi)神經(jīng)元密度降低、或脫失、或變性壞死等，皆可造成學(xué)習(xí)記憶能力衰退或障礙。尼氏體是由神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)發(fā)達的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分布其間的游離核糖體構(gòu)成，是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一，具有活躍的蛋白質(zhì)合成功能，主要合成更新細胞器所需的結(jié)構(gòu)蛋白、合成神經(jīng)遞質(zhì)所需的酶類以及肽類的神經(jīng)調(diào)質(zhì)[3]，它是反映神經(jīng)元功能活性的形態(tài)指標(biāo)。海馬中尼氏體的多少能反映學(xué)習(xí)記憶能力的變化情況，有研究顯示，在大鼠海馬神經(jīng)元胞體中的尼氏體含量明顯減少的同時，其記憶能力下降[4]。本實驗結(jié)果顯示，LN組大鼠海馬中尼氏體IOD與QN組比較顯著下降；LN-HTMJ高劑量組海馬中尼氏體IOD與LN組比較均顯著增加。這一結(jié)果表明，大鼠長到老年，其海馬中尼氏體明顯減少；而核桃酶解提取物能明顯延緩它的減少。乙酰膽堿(Ach)是中樞膽堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在學(xué)習(xí)記憶中起著非常重要的作用，海馬組織中的Ach更是如此。當(dāng)大腦內(nèi)Ach水平提高時，記憶能力則會增加[5]，Ach與AchE的活性呈負(fù)相關(guān)[6]。因為Ach性質(zhì)不穩(wěn)定，容易水解，直接準(zhǔn)確檢測其含量難度較大，所以通過檢測AchE以間接地反映Ach的水平[7]。本實驗結(jié)果顯示，LN組大鼠海馬中AchE水平皆顯著高于QN組，而LN-HTMJ高劑量組的AchE水平皆明顯低于LN組。這一結(jié)果表明，老年大鼠海馬中的AchE水平較青年大鼠顯著增高，而核桃酶解提取物能使其降低；由此也說明，老年大鼠海馬中的Ach水平顯著低于青年大鼠，而核桃酶解提取物具有提高其水平的作用。

大腦皮質(zhì)是參與哺乳動物學(xué)習(xí)記憶的另一個主要腦區(qū)，其中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在這一過程發(fā)揮著非常重要的作用。業(yè)已證實，NE在記憶保持方面起重要作用，而改善記憶與DA密切相關(guān)[8]，它們含量的降低是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力衰退的主要原因之一[9]。本實驗結(jié)果顯示： LN組大鼠大腦皮質(zhì)中DA和NE含量較QN組顯著降低，從而進一步驗證了這一點。與LN組比較，LN-HTMJ高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中DA和NE含量皆明顯增高。這一結(jié)果表明，核桃酶解提取物能夠提高老年大鼠大腦皮質(zhì)中的NE和DA含量，由此達到延緩其記憶力衰退的作用。

下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸在機體衰老過程中起重要作用。業(yè)已證實，該軸功能紊亂與衰老關(guān)系密切。如有研究表明，老年人基礎(chǔ)皮質(zhì)醇水平升高[10]，降低垂體激素的分泌，可延長實驗動物的壽命；老年大鼠外周血中CORT水平增高[11]。海馬對HPA軸的活性具有抑制作用[12]。有研究顯示，隨著大鼠衰老，腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，海馬呈穩(wěn)態(tài)下降，進而使其對HPA軸的抑制作用減弱，導(dǎo)致HPA軸功能亢進[13]。海馬存在高密度糖皮質(zhì)激素受體，是糖皮質(zhì)激素(GC)作用的敏感部位；長期高水平的GC會對海馬區(qū)域神經(jīng)元產(chǎn)生損傷[12-14]，所以衰老機體GC的長期增高會進一步損害海馬，因此也就進一步減弱了其對HPA軸的抑制作用，由此導(dǎo)致HPA軸的進行性和持久性亢進，形成GC損傷的放大效應(yīng)[13]。繼而進一步導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力衰退，也就是為什么老年人出現(xiàn)皮質(zhì)醇和老年大鼠出現(xiàn)CORT含量增加的原因所在。本實驗結(jié)果顯示：LN組大鼠外周血漿中ACTH和血清中CORT含量均顯著高于QN組；與LN組比較， LN-HTMJ高劑量組的ACTH和CORT含量均明顯降低。這一結(jié)果表明，21月齡SD大鼠HPA軸出現(xiàn)了明顯的功能亢進，而核桃酶解提取物能使其外周血漿中ACTH和血清中CORT含量降低，表現(xiàn)出兩者對衰老所致HPA軸功能亢進具有一定的對抗作用。

中醫(yī)認(rèn)為心藏神，主神志，目前公認(rèn)，心的這一生理功能當(dāng)屬于腦，即中醫(yī)的心包含有腦的功能。正如清·王清任所言“靈機記性在腦”。本實驗研究顯示，老年大鼠在記憶力衰退的同時，其海馬中尼氏體減少、AchE水平增高以及大腦皮質(zhì)中DA、NE含量降低，表明海馬以及上述神經(jīng)遞質(zhì)是“心主神志”的物質(zhì)基礎(chǔ)，它們發(fā)生異常改變是“心主神志”功能減退的原因之一。而核桃酶解提取物能使上述指標(biāo)在一定程度上發(fā)生逆轉(zhuǎn)，說明它們能通過對“心”的調(diào)節(jié)而達到延緩記憶力衰退的作用。中醫(yī)的“腎”在維持記憶功能的過程中也起著重要的作用，這是因為腎藏精、精生髓而腦為髓之海有賴髓之滋養(yǎng)。腎精充實則髓之化生充沛，腦得其充分滋養(yǎng)，靈機記憶則強；若腎精虧虛則髓之化生缺乏，腦失其充分滋養(yǎng)，靈機記憶則弱。隨著年齡的增長，腎中精氣也隨之由盛轉(zhuǎn)衰，學(xué)習(xí)記憶也就逐漸衰退，因此“腎虛”在衰老過程中起著非常重要的作用。本實驗結(jié)果說明，21月齡SD老年大鼠記憶力明顯衰退，呈現(xiàn)出“腎虛”狀態(tài)。長期研究表明，中醫(yī)的“腎”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能”密切相關(guān)，這其中尤與“中樞神經(jīng)遞質(zhì)-HPA軸功能”關(guān)系密切，其功能發(fā)生紊亂是“腎虛證”的表現(xiàn)形式之一。本實驗結(jié)果顯示，與青年大鼠比較，老年大鼠海馬中尼氏體減少、AchE水平增高以及大腦皮質(zhì)中DA、NE含量降低；與此同時，老年大鼠外周血漿中ACTH和血清中CORT含量增加，而核桃酶解提取物能在一定程度上使上述指標(biāo)發(fā)生逆轉(zhuǎn)。這表明老年大鼠中樞神經(jīng)遞質(zhì)-HPA軸功能發(fā)生了紊亂，并由此進一步證明老年“腎虛證”與中樞神經(jīng)遞質(zhì)-HPA軸功能紊亂密切相關(guān)；而核桃酶解提取物能通過“補腎”，使老年腎虛大鼠紊亂的中樞神經(jīng)遞質(zhì)-HPA軸功能得到一定程度的恢復(fù)，進而達到延緩記憶力衰退的作用。

由上觀之，“心”與“腎”密切相關(guān)，海馬以及大腦皮質(zhì)中的DA、NE等神經(jīng)遞質(zhì)是兩者聯(lián)系的紐帶；并提示核桃酶解提取物可通過“調(diào)補心腎”達到延緩記憶力衰退的作用。

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梁 明(1978 -)，女，湖北人，生藥學(xué)碩士，從事中藥學(xué)的研究。

△通訊作者：劉梅潔(1981-)，女，河南南陽人，醫(yī)學(xué)博士，Tel：010-64089528，E-mail：meimei64571@sina.com。

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