鄭海生，蔣 健

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021)

【中醫(yī)多學(xué)科研究】

基于代謝組學(xué)慢性心力衰竭腎陽虛證代謝模式的研究

鄭海生1，蔣 健2△

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021)

目的： 探討基于色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)及模式識別為主的代謝組學(xué)技術(shù)及其方法，研究慢性心力衰竭腎陽虛證的代謝模式及相應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)的變化。方法： 收集正常人以及臨床常見慢性心力衰竭腎陽虛證與氣陰兩虛證病例的尿樣，以LC/MS為代謝組學(xué)研究方法，檢測分析各組間尿樣中代謝模式的差異。結(jié)果：代謝組學(xué)研究表明，與正常組比較慢性心衰組有21種內(nèi)源性化合物含量與正常組有明顯不同；與氣陰兩虛組比較，慢性心力衰竭腎陽虛組有16種內(nèi)源性化合物含量與氣陰兩虛組有明顯不同。結(jié)論：以代謝模式改變?yōu)橐罁?jù)的代謝組學(xué)研究方法，通過代謝通路成功地將不同證型加以區(qū)分，說明代謝組學(xué)技術(shù)及其方法研究中醫(yī)學(xué)證本質(zhì)的思路及方法可行，從代謝模式的角度闡述中醫(yī)證本質(zhì)是中醫(yī)現(xiàn)代化可實踐和深化的技術(shù)和方法學(xué)體系。

腎陽虛證；證本質(zhì)；代謝組學(xué)；同病異證

代謝組學(xué)正處于快速發(fā)展階段，日益成為研究的熱點。高通量、高分辨率的分析技術(shù)與生物信息學(xué)相整合，對生物代謝層面進行研究提供了解生物體的獨特視角。代謝組中各代謝產(chǎn)物水平的高低與發(fā)育、生理、病理狀態(tài)有關(guān)，代謝組是一個細胞或組織的生物化學(xué)表現(xiàn)型[1](the biochemical phenotype of a cell or tissue)。代謝組學(xué)通過整體、動態(tài)的方法研究人體生理病理狀態(tài)，可把與臟腑生理病理密切相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化反映出來。

本研究將從臨床慢性心力衰竭(CHF)腎陽虛病人著手，探討臨床腎陽虛病例與非腎陽虛病例之間不同的代謝網(wǎng)絡(luò)變化模式，試圖找到這些疾病共性的代謝途徑，即腎陽虛代謝組學(xué)特征譜，探究中醫(yī)證候?qū)W在代謝網(wǎng)絡(luò)層面的生物學(xué)本質(zhì)，為尋找中西醫(yī)結(jié)合治療這些疾病提供思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2008年6月至2008年12月上海市曙光醫(yī)院心內(nèi)科確診的慢性心衰患者72例，其中腎陽虛組38人，年齡(65.12±6.78)歲；氣陰兩虛組24人，年齡(68.43±10.60)歲；正常對照組48人，年齡(67.56±11.26)歲。所有樣本排除應(yīng)激及冠心病、溶血性疾病、肝腎功能異常及感染者、精神病患者;妊娠或哺乳期婦女。各證型組患者年齡、病程、心衰水平分級比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 入組標準

慢性心力衰竭的西醫(yī)診斷標準參照Framingham心力衰竭標準[2]。慢性心力衰竭中醫(yī)腎陽虛證診斷標準參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[3]。正常對照組入選標準：健康體檢者經(jīng)詳細體檢及胸透、心電圖、血壓、血尿常規(guī)、血糖、肝腎功能等理化檢查，評定無心、腦、肝、腎、肺和內(nèi)分泌等主要器官系統(tǒng)的實質(zhì)性病變者。

2 檢測儀器及方法

2.1 檢測儀器

實驗儀器、材料及試劑由上海交通大學(xué)分析測試中心提供。色譜純甲醇、色譜純乙腈、色譜純甲酸均購自Merck公司；Waters 中國有限公司超高效液相色譜單級四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC/QTOFMS型號Acquity Ultra Performance LC-Q-TOF premie)、Waters 中國有限公司UPLC C18色譜柱 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Millipore中國有限公司Milli-Q超純水系統(tǒng)(型號Milli-Q Adventage)Waters中國有限公司MassLynx操作系統(tǒng)。所用試劑氯甲酸乙酯(ECF)、氯仿、無水乙醇、吡啶、氫氧化鈉、無水硫酸鈉皆為分析純，購自上海潤潔化學(xué)試劑有限公司。內(nèi)標：L-2-氯苯丙氨酸，購自美國SIGMA公司。

2.2 尿液樣品的采集及預(yù)處理

采集納入研究的慢性心力衰竭和慢性腎功能衰竭患者的腎陽虛證和非腎陽虛證及健康對照者的空腹晨尿(用樣品桶收集患者入院當日晚上12∶00至次日晨8∶00的尿液混勻)約10 ml,置于15ml有蓋圓底塑料離心管，立即放置于低溫冰箱-80℃冷凍保存待實驗。在實驗前將尿液樣品取出，常溫下解凍、搖勻，采集2 ml放入離心機5000 r/min(rpm)離心5 min，進行LC-MS分析。

2.3 流動相條件

試驗中流動相設(shè)定為流動相A:水+0.1%甲酸；流動相B:乙腈+0.1%甲酸。

2.4 UPLC/QTOFMS分析條件

質(zhì)譜條件：以氮氣作為霧化、錐孔氣；電噴霧電離正離子模式；飛行管檢測模式V型；毛細管電壓(capillary voltage) 3.5 kV；錐孔電壓(Sampling cone) 35v；萃取錐孔(Extraction cone) 3v；源溫 (Source temperature) 100℃；脫溶劑氣溫度(Desolvation temperation) 400℃；反向錐孔氣流(Cone gas flow) 50l/h；脫溶劑氣(Desolvation gas flow) 600 l/h；低質(zhì)量區(qū)分辨率(Lm resolution) 4.7v；高質(zhì)量區(qū)分辨率(Hm resolution)15v；離子能量(Ion energy) 0；碰撞能量(Collision energy) 6v；碰撞池入口(Collision cell entrance) 2v；碰撞池出口(Collision cell exit) -10v；碰撞氣流速(Collision gas flow) 0.5 mL/min；檢測器(Detector) 1700v；掃描時間(Scan time) 1s；掃描時間間隔(Inter scan time) 0.02s; 質(zhì)荷比范圍：50～1000 m/z。

表1 流動相洗脫梯度

2.5 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)的提取方法用UPLC/QTOFMS配套的MarkerLynx (waters)軟件，進行基線矯正、峰判別與匹配、內(nèi)標和系統(tǒng)雜峰的排除和峰的歸一化等計算過程，最終得到由指定的峰序列號(保留時間/質(zhì)荷比)、觀測點(樣品號)以及歸一化后峰面積組成的三維矩陣數(shù)據(jù)集，導(dǎo)入Simca-P12.0軟件進行OPLS-DA(正交偏最小二乘法判別)分析，運用變量投影重要性分析(VIP, variable importance for the projection)方法區(qū)分組間代謝輪廓貢獻較大的代謝物。多維統(tǒng)計中找到的差異代謝物，應(yīng)用SPSS 17. 0統(tǒng)計軟件進行Kruskal-Wallis檢驗和單因素ANOVA分析驗證，結(jié)合VIP值大于5并差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的代謝物確定為潛在標記物。

3 結(jié)果

3.1 各組尿液代謝物分析在同一保留時間，各組尿液色譜峰大小、高低表達有差異(圖1)。模式識別分析結(jié)果顯示，正常對照組與慢性心力衰竭組尿液代謝物呈明顯的分離趨勢 (圖2)，慢性心衰腎陽虛組與氣陰兩虛組尿液代謝物完全分離(圖5)。

圖1 心衰病人與正常人尿樣UPLC/QTOFMS總離子流圖

圖2 正常組與慢性心衰組尿液代謝組學(xué)PLS-DA得分圖注：CLASS1=正常組，CLASS2=心衰組

圖3 正常組與慢性心衰組尿液SIMCA-P12.0-PLS分析結(jié)果負載圖

圖4 VIP>5的物質(zhì)28個，其中能初步鑒定20個

圖5 慢性心衰中腎陽虛VS氣陰兩虛尿液代謝組學(xué)PLS-DA得分圖注：CLASS1=氣陰兩虛，CLASS2=腎陽虛

圖7 S_PLOT VIP>5共21個，可以初步鑒定的物質(zhì)16個

3.2 潛在標記物采用UPLC/QTOFMS自帶的相似性匹配軟件結(jié)合保留時間，將正常組與慢性心力衰竭各個峰歸屬為特定的物質(zhì)，找到2組共有的內(nèi)源性物質(zhì)29種(圖3)；慢性心衰腎陽虛組與氣陰兩虛組共有內(nèi)源性物質(zhì)21種(圖6)。進一步用OPLS-DA法對正常組與慢性心衰組尿液樣本共有的29種代謝物重新建模，尋找VIP>5的高度相關(guān)代謝物。通過NISTOS標準質(zhì)譜圖庫和標準品對照進行質(zhì)譜信息匹配，對可能的代謝標記物進行初步鑒定。與正常組比較，慢性心衰組有21種內(nèi)源性化合物含量與正常組有明顯不同(圖4)。為尋找與各中醫(yī)證型高度相關(guān)的代謝物，用OPLS-DA法對慢性心衰腎陽虛組與氣陰兩虛組尿液樣本共有的21種代謝物重新建模，尋找VIP>5的高度相關(guān)代謝物，與氣陰兩虛組比較，慢性心衰腎陽虛組有16種內(nèi)源性化合物含量與氣陰兩虛組有明顯不同(圖7)。

4 討論

本功研究顯示，從單個病種的研究中，慢性心力衰竭患者的代謝模式圖與正常組在空間分布上呈分離趨勢，并得到可以確認的21種含量不同的代謝產(chǎn)物，即代謝組學(xué)技術(shù)成功地進行了“辨病”。 進一步以慢性心力衰竭腎陽虛組和氣陰兩虛組進行研究發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭患者的腎陽虛組和氣陰兩虛組代謝模式圖在空間分布上呈分離趨勢，并得到2組間可以確認的16種含量不同的代謝產(chǎn)物，提示利用代謝組學(xué)技術(shù)及方法可以實現(xiàn)中醫(yī)證型的區(qū)分，達到“辨證”的目的。

從代謝組學(xué)所得到的這些不同的差異代謝物是各個代謝途徑中能反映整體信息的一些關(guān)鍵信息點，其可以從能量代謝、微量氨基酸代謝、腸道菌群代謝等具體的代謝網(wǎng)絡(luò)途徑，由點到面地區(qū)分了慢性心力衰竭患者腎陽虛組與氣陰兩虛組不同的代謝模式，同時這些差異性代謝物可反映與具體病理生理相對應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生異常后物質(zhì)和功能的改變。這種以組學(xué)闡釋的方式可以更好地將中醫(yī)證型所具有的多層次、復(fù)合性物質(zhì)變化與整體觀得以明確的表達。

與實驗室生化指標相比，這種以系統(tǒng)整體的角度通過代謝網(wǎng)絡(luò)層面闡述病與證的不同代謝模式的技術(shù)及方法更適合運用于中醫(yī)證型本質(zhì)的探討與研究。由于其以組學(xué)的形式和相互關(guān)聯(lián)的多個代謝標志物來進行相關(guān)病與證的不同的代謝模式的區(qū)分，與實驗室經(jīng)典生化指標相比，其可以顧及一般生化指標中不被關(guān)注，但極可能是反映“證”概念特點的重要物質(zhì)。并通過研究其對應(yīng)的相關(guān)代謝通路，探究并發(fā)現(xiàn)與“證”概念相關(guān)的代謝模式，便于我們更深入地了解具有整體性與復(fù)合性的中醫(yī)“證”概念所反映的病理生理過程中物質(zhì)和功能的變化過程。本次的代謝組學(xué)研究結(jié)果說明，這種組學(xué)研究方法在區(qū)分不同病或證上已體現(xiàn)出方法學(xué)的優(yōu)勢，這也可能同樣對于具有相近證概念(如脾陽虛證)提供了相應(yīng)的方法學(xué)支持，而彌補或改觀單純靠實驗室指標所呈現(xiàn)的區(qū)分“證”型指標特異性差的特點。從本次對慢性心力衰竭病證結(jié)合研究結(jié)果可驗證，代謝組學(xué)方法在中醫(yī)證型研究中的方法學(xué)優(yōu)勢與可行性。本研究從代謝組學(xué)小分子水平初步反映了慢性心力衰竭腎陽虛證、氣陰兩虛證代謝特征，從生物代謝角度為研究中醫(yī)證候的現(xiàn)代內(nèi)涵提供了實驗依據(jù)，以期為中醫(yī)證候本質(zhì)研究作出有益的探索。

[1] 邱德有，黃璐琦.代謝組學(xué)研究-功能基因組學(xué)研究的重要組成部分[J].分子植物育種，2004，2(2)：165-177.

[2] 張建，華琦. 心力衰竭的診斷與治療[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006:173-175.

[3] 鄭筱萸. 中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002:80-81.

【臨床基礎(chǔ)】

Kidney-Yang Deficiency Metabolic Mode Research in Chronic Heart Failure Based on Metabonomics

ZHENG Hai-sheng1，JIANG Jian2△

(1.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004，China; 2.DawnHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200021,China)

Objective: To investigate kidney yang deficiency metabolic patterns and metabolic networks changes by metabolomics which based on GC/MS and pattern recognition. It is to construct a methodology to suitable for TCM’s syndrome theories. Methods: Collecting urine samples of chronic heart failure patients who appear kidney yang deficiency syndrome and Qi deficiency and Yin deficiency syndrome. Then their different metabolic patterns is to be distinguished metabolic profiling changes. 72 patients were divide into 2 groups: 38 chronic heart failure cases in the kidney deficiency syndrome group,24 chronic heart failure cases in the Qi deficiency and Yin deficiency syndrome group,48 normal people to be treated as control group. And collecting the first time urine samples after hospitalization is to be collected and applied to study metabolic pattern change of control group，kidney Yang deficiency and Qi deficiency and Yin deficiency syndrome. Results: The metabolomics indexes showed chronic heart failure and control group’s metabolomic pattern graph distribute different area, at the same time chronic heart failure kidney yang deficiency group and Qi deficiency and Yin deficiency syndrome group metabolomic pattern graph also distribute different area. Conclusion: The metabolomics is showed chronic heart failure and normal people can be distinguished by LC/MS. Meanwhile chronic heart failure and chronic kidney failure disease’s kidney yang deficiency and non-kidney yang deficiency can be distinguished by LC/MS. They discriminate kidney yang deficiency and non-kidney yang deficiency different metabolomic pattern. The results certificate metabolomics technology can be applied in the investigation of TCM syndrome. This technology should be expanded and strengthened.

Kidney yang deficiency； Syndrome essence；Metabolomics；Same syndrome for different diseases

國家自然科學(xué)基金資助項目(30572286)-基于代謝組學(xué)的腎陽虛證本質(zhì)的研究

鄭海生(1975-)，男，甘肅渭源人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)內(nèi)科理論研究。

△通訊作者：蔣 健(1956-)，男，江蘇蘇州人,主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士,從事中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科消化病研究，Tel: E-mail:

R541.6+1

A

1006-3250(2017)05-0645-03

2016-10-21