朱 迪 李婷婷 陳青松 牟 童 湯成泳

(1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科, 2 藥學(xué)部 重慶 400016)

IL-37通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用

朱 迪1李婷婷1陳青松1牟 童1湯成泳2△

(1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科,2藥學(xué)部 重慶 400016)

目的 探討IL-37通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化在缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用及其相關(guān)分子機(jī)制。方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)和Western blot檢測(cè)在不同極化類型的人單核巨噬細(xì)胞THP-1中IL-37 mRNA和蛋白質(zhì)水平。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)IL-37的細(xì)胞株,qRT-PCR檢測(cè)CD206、CD86、ARG1和iNOS mRNA水平,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD163、CD86蛋白質(zhì)水平。通過(guò)Transwell法將THP-1細(xì)胞與人肝細(xì)胞L02細(xì)胞共培養(yǎng)并構(gòu)建H/R模型,CCK-8法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)L02細(xì)胞存活率及凋亡率,ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)含量,HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化。Western blot檢測(cè)THP-1細(xì)胞中STAT6及其磷酸化水平。結(jié)果 M2型巨噬細(xì)胞中IL-37 mRNA及蛋白質(zhì)水平上調(diào)。IL-37促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化。IL-37誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞與L02細(xì)胞共培養(yǎng),在H/R狀態(tài)下顯著提高肝細(xì)胞存活率(P=0.015),并降低細(xì)胞凋亡率和ALT、AST水平(P<0.001),減輕細(xì)胞損傷。 Western blot提示過(guò)表達(dá)IL-37的 THP-1細(xì)胞中STAT6蛋白質(zhì)磷酸化水平上調(diào)(P<0.01)。結(jié)論 IL-37能促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化,并對(duì)H/R誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與STAT6信號(hào)通路有關(guān)。

IL-37; 巨噬細(xì)胞; 缺氧/復(fù)氧; 肝細(xì)胞損傷

肝缺血再灌注損傷 (hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI) 指肝臟因各種原因?qū)е卵髦袛嗷虿蛔?在恢復(fù)血供之后不僅不能使器官功能恢復(fù),反而加重其功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷的現(xiàn)象。在肝外科及肝移植手術(shù)中HIRI是造成肝功能損害的重要因素,其損傷機(jī)制及臟器保護(hù)機(jī)制越來(lái)越受到重視。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞,在不同的微環(huán)境下可極化為經(jīng)典活化型(M1型)和替代活化型(M2型)[1]。巨噬細(xì)胞在肝[2-3]、腎[4]、心[5]、腸[6]等器官缺血再灌注損傷中起保護(hù)作用,且M2型極化可能在其中起重要作用。IL-37是IL-1家族成員,可起到抑制固有免疫的作用,可能對(duì)巨噬細(xì)胞的極化起到潛在的影響,但其具體作用及機(jī)制尚不明確[7]。Wang等[8]的研究提出對(duì)人肝細(xì)胞系L02進(jìn)行缺氧/復(fù)氧(hypoxia reoxygenation,H/R)處理可建立有效的HIRI體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

為了研究IL-37基因與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系,探討其對(duì)H/R誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的作用,本研究檢測(cè)IL-37基因在不同極化類型的人單核巨噬細(xì)胞系THP-1的表達(dá)情況,將表達(dá)IL-37基因和空載體的慢病毒轉(zhuǎn)染至THP-1細(xì)胞,與人肝細(xì)胞系L02共培養(yǎng),建立細(xì)胞H/R損傷模型,并進(jìn)行相關(guān)功能和機(jī)制檢測(cè),探討IL-37是否通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化在H/R狀態(tài)下對(duì)L02細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

主要試劑和藥品 THP-1和L02細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心贈(zèng)予;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;TranswellTM小室(0.4 μm孔徑)購(gòu)自美國(guó)Corning公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所;Annexin V-PE試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT,)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)微板測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;人重組IL-4、IL-13、γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)及LPS購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;鼠抗IL-37單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;兔抗STAT6單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;佛波酯(phorbol 12-myristste 3-acetate,PMA)及兔抗磷酸化STAT6 [phosphor-STAT(Tyr641),p-STAT6]抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;兔抗GAPDH抗體購(gòu)自重慶惠而利生物技術(shù)有限公司;Trizol、PrimeScript RT試劑盒購(gòu)自TaKaRa-寶生物工程(大連)有限公司;qPCR Master Mix試劑購(gòu)自美國(guó)Selleck中國(guó)公司;PCR引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;RIPA蛋白質(zhì)裂解液、BCA試劑盒、HE染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;人IL-37重組慢病毒表達(dá)載體和對(duì)照載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司,重組質(zhì)粒構(gòu)建和慢病毒包裝由本研究小組前期完成[9]。

細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)THP-1和L02細(xì)胞株。THP-1細(xì)胞隔天加入2 mL新鮮培養(yǎng)基并小心吹打混勻,L02細(xì)胞每天更換2 mL新鮮培養(yǎng)基。

穩(wěn)定過(guò)表達(dá)IL-37的細(xì)胞株構(gòu)建 將THP-1細(xì)胞接種于12孔板中,用人IL-37重組慢病毒表達(dá)載體(LV-37)和對(duì)照載體(LV-NC)感染細(xì)胞,病毒接觸細(xì)胞12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。72 h后,培養(yǎng)液中加入質(zhì)量濃度1 μg/mL的嘌呤霉素并培養(yǎng)1周。在藥物篩選下最后存活的細(xì)胞為穩(wěn)定株。

Transwell共培養(yǎng)及H/R模型的建立 將孔徑為0.4 μm的Transwell小室置于6孔板中,上下室分別加入1 mL含有150 nmol/L PMA的新鮮培養(yǎng)基,并在上室中加入1×106個(gè)左右的THP-1細(xì)胞,孵育24 h將其誘導(dǎo)分化為T(mén)HP-1源性巨噬細(xì)胞。24 h后鏡下觀察細(xì)胞已貼壁,棄培養(yǎng)基,用PBS清洗2次并更換新鮮培養(yǎng)基。將L02細(xì)胞接種于6孔板中,孵育24 h使其充分貼壁,鏡下觀察細(xì)胞匯合度60%～70%左右時(shí),將種有THP-1源性巨噬細(xì)胞的Transwell小室放入接種有L02細(xì)胞的6孔板中進(jìn)行共培養(yǎng)。上下室分別用PBS清洗后,更換不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,將細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱(1% O2、5% CO2、94% N2)中缺氧培養(yǎng)12 h,移至正常培養(yǎng)箱中復(fù)氧4 h,構(gòu)建H/R模型。

巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 將THP-1細(xì)胞調(diào)整為1×106/mL的細(xì)胞懸液,接種于6孔板中,每孔1.5 mL,并加入150 nmol/L PMA,避光孵育24 h,鏡下觀察細(xì)胞已貼壁,表明THP-1已分化為巨噬細(xì)胞。棄培養(yǎng)基,用37 ℃預(yù)熱的PBS清洗2次,更換新鮮培養(yǎng)基。分為3組進(jìn)行處理:M1組,加入IFN-γ 20 ng/mL和脂多糖(lipopolysaccharides,LPS) 10 g/mL孵育24 h,使其極化為M1型巨噬細(xì)胞;M2組,加入IL-4 20 ng/mL和IL-13 20 ng/mL孵育24 h,使其極化為M2型巨噬細(xì)胞;M0組,不作任何處理,為空白對(duì)照組。

H/R實(shí)驗(yàn)分組 將Transwell共培養(yǎng)的細(xì)胞分為4組建立H/R模型,空白對(duì)照組:不進(jìn)行H/R處理,與轉(zhuǎn)染LV-NC陰性對(duì)照病毒的THP-1源性巨噬細(xì)胞共培養(yǎng);IL-37實(shí)驗(yàn)組:不進(jìn)行H/R處理,與轉(zhuǎn)染LV-37病毒的THP-1源性巨噬細(xì)胞共培養(yǎng);H/R處理組:進(jìn)行H/R處理,與轉(zhuǎn)染LV-NC陰性對(duì)照病毒的THP-1源性巨噬細(xì)胞共培養(yǎng);H/R+LV-37實(shí)驗(yàn)組:進(jìn)行H/R處理,與轉(zhuǎn)染LV-37病毒的THP-1源性巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。

qRT-PCR檢測(cè)mRNA水平 取經(jīng)過(guò)處理的各組THP-1細(xì)胞,根據(jù)Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA,并按PrimeScript RT試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)qPCR反應(yīng)混合物說(shuō)明書(shū),進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)IL-37 mRNA水平,反應(yīng)條件:95 ℃下10 min;95 ℃下5 s、60 ℃下30 s,共40個(gè)循環(huán);95 ℃下10 s。GAPDH為內(nèi)參基因,以2-ΔΔCt值表示IL-37 mRNA水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR反應(yīng)所用引物序列

F:Forward;R:Reverse.

Western blot法檢測(cè)蛋白質(zhì)水平 取經(jīng)過(guò)處理的各組THP-1細(xì)胞,按照RIPA蛋白質(zhì)裂解液說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白,用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。以每孔50 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE,然后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗稀釋液(稀釋比例1∶1 000) 4 ℃孵育過(guò)夜。次日以TBST充分洗滌后加入二抗稀釋液(稀釋比例1∶5 000) 37 ℃孵育1 h。TBST充分洗滌后以ECL顯影劑顯色并進(jìn)行灰度值分析。

CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率 分別將轉(zhuǎn)染LV-37和LV-NC的THP-1細(xì)胞接種于6孔板并誘導(dǎo)分化為T(mén)HP-1源性巨噬細(xì)胞。24 h后更換為不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h后吸取上清,800×g離心10 min去除殘余細(xì)胞,收集上清備用。將L02細(xì)胞接種于96孔板中,在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h,待細(xì)胞匯合率達(dá)70%左右時(shí)進(jìn)行H/R實(shí)驗(yàn),分組同H/R實(shí)驗(yàn)分組,PBS沖洗2次后,LV-37組加入200 μL轉(zhuǎn)染LV-37的THP-1源性巨噬細(xì)胞上清,LV-NC組加入200 μL 轉(zhuǎn)染LV-NC的THP-1源性巨噬細(xì)胞上清。另設(shè)除零組(只加入培養(yǎng)基,不接種細(xì)胞)和空白組(加入200 μL不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,不進(jìn)行H/R處理)。H/R組建立H/R模型,方法同上。復(fù)氧結(jié)束后,每孔加入20 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值D450。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá) 用0.25%的胰蛋白酶消化經(jīng)建模處理后的各組THP-1細(xì)胞,60×g離心5 min收集細(xì)胞,PBS洗滌2次,用100 μL PBS重懸細(xì)胞,以每5 μL含1×106個(gè)細(xì)胞的比例分別加入APC抗人CD86熒光抗體和PE抗人CD163熒光抗體,混勻后避光冰上放置30 min,每10 min輕柔震蕩5 s,PBS洗滌2次,用200 μL PBS重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光染色情況。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用0.25%的胰蛋白酶消化經(jīng)建模處理后的各組L02細(xì)胞,60×g離心5 min,收集細(xì)胞,按Annexin V-PE細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)處理細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

檢測(cè)ALT、AST活力 取經(jīng)建模處理后的各組L02細(xì)胞培養(yǎng)液,800×g離心10 min,去除殘存細(xì)胞,收集上清,按ALT、AST微板測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作,測(cè)定ALT、AST活力。

HE染色 取經(jīng)建模處理后的各組L02細(xì)胞,按照HE染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,進(jìn)行HE染色,并于100倍光鏡下觀察、拍照。

結(jié) 果

M2型巨噬細(xì)胞中IL-37mRNA及蛋白質(zhì)水平上調(diào) 分別提取M1、M2和M0型THP-1源性巨噬細(xì)胞的總mRNA和總蛋白,采用qRT-PCR檢測(cè)CD206、CD86和IL-37mRNA水平(圖1A),M2型巨噬細(xì)胞中CD206mRNA水平顯著高于M1型(P=0.004)和M0型(P=0.008),M1型巨噬細(xì)胞中CD86mRNA水平顯著高于M2型(P=0.001)和M0型(P=0.002),提示誘導(dǎo)分化成功;IL-37mRNA水平顯著高于M1型和M0型(P<0.001);采用Westernblot檢測(cè)IL-37蛋白質(zhì)水平(圖1B),M2型巨噬細(xì)胞中IL-37蛋白質(zhì)水平顯著高于M1型(P=0.042)和M0型(P=0.002)。

建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)IL-37的THP-1細(xì)胞株 將人IL-37重組慢病毒表達(dá)載體(LV-37)和對(duì)照載體(LV-NC)轉(zhuǎn)染入THP-1細(xì)胞。采用qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)IL-37表達(dá)水平,結(jié)果顯示,LV-37THP-1細(xì)胞的IL-37mRNA水平(圖2A,P=0.011)和蛋白質(zhì)水平(圖7,P=0.03)明顯高于LV-NCTHP-1細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證明穩(wěn)定過(guò)表達(dá)IL-37的THP-1細(xì)胞株構(gòu)建成功。

IL-37促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化 使用LV-37及LV-NC慢病毒轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞,誘導(dǎo)其分化為T(mén)HP-1源性巨噬細(xì)胞后構(gòu)建H/R模型,分別提取LV-37組和LV-NC組細(xì)胞的總mRNA,采用qRT-PCR檢測(cè)IL-37、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206、ARG1和M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD86、iNOS的mRNA水平,并收集各組細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD163和M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86蛋白質(zhì)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示,LV-37組CD206 (P=0.001)和ARG1(P=0.02)的mRNA水平高于LV-NC組,CD86 (P=0.001)和iNOS(P=0.015)的mRNA水平低于LV-NC組(圖2A)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,LV-37組CD163熒光染色陽(yáng)性率為57.933%±1.443%,CD86熒光染色陽(yáng)性率為31.867%±1.960%;LV-NC組CD163熒光染色陽(yáng)性率為22.433%±2.307%,CD86熒光染色陽(yáng)性率為50.267%±2.970%(圖2B)。與LV-NC組相比,LV-37組CD163表達(dá)顯著提高(P<0.001),同時(shí)CD86表達(dá)顯著降低(P=0.001)。以上結(jié)果證明,IL-37表達(dá)上調(diào)可在mRNA和蛋白質(zhì)水平增加M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)水平,說(shuō)明IL-37可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化。

IL-37誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞在H/R狀態(tài)下提高肝細(xì)胞存活率LV-37組和LV-NC組THP-1源性巨噬細(xì)胞與L02細(xì)胞共培養(yǎng)并構(gòu)建H/R模型,通過(guò)CCK-8檢測(cè)L02細(xì)胞存活率,結(jié)果顯示,空白對(duì)照組、IL-37實(shí)驗(yàn)組、H/R處理組、H/R+IL-37實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率分別為100.381%±6.220%、97.109%±7.558%、53.472%±4.996%和68.668%±4.876%。如圖3所示,與空白對(duì)照組相比,H/R處理組和H/R+IL-37實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.001);與H/R處理組相比,H/R+LV-37實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率顯著提高(P=0.015)。

IL-37誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞在H/R狀態(tài)下降低肝細(xì)胞凋亡率 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)L02細(xì)胞凋亡率,空白對(duì)照組、IL-37實(shí)驗(yàn)組、H/R處理組、H/R+IL-37實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率分別為4.597%±0.405%、5.060%±1.608%、16.247%±1.486%和IL-37誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞在H/R狀態(tài)下降低ALT、AST水平 比較各組細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST水平,與空白對(duì)照組相比,H/R處理組和H/R+LV-37實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ALT、AST活力顯著上升(P<0.001);與H/R處理組相比,H/R+LV-37實(shí)驗(yàn)組ALT水平顯著降低(P=0.006,圖5A);同時(shí),H/R+LV-37實(shí)驗(yàn)組AST水平較H/R處理組也顯著降低(P=0.005,圖5B)。

(1)P<0.005,(2)P<0.05.

圖1 M2型巨噬細(xì)胞中IL-37 mRNA及蛋白質(zhì)水平

Fig 1 mRNA and protein levels of IL-37 in M2 macrophages

(1)P<0.05,(2)P<0.005.

圖2 IL-37促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化

Fig 2 IL-37 induces polarization of M2-type macrophages

10.480%±0.942% (圖4)。與空白對(duì)照組相比,H/R處理組和H/R+IL-37實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.001);與H/R處理組相比,H/R+LV-37實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.001)。

圖3 H/R狀態(tài)下IL-37誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)L02細(xì)胞存活的影響

HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 取經(jīng)建模處理后的各組L02細(xì)胞采用HE染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。在光鏡下觀察,空白對(duì)照組和IL-37實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好,形狀較規(guī)則,呈多角形或梭形。與空白對(duì)照組相比,H/R處理組細(xì)胞皺縮、體積縮小,形態(tài)欠規(guī)則,細(xì)胞核固縮碎裂,培養(yǎng)液中有較多細(xì)胞碎片存在。與H/R處理組相比,H/R+IL-37實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化較小,受損細(xì)胞明顯減少(圖6)。

IL-37促進(jìn)THP-1細(xì)胞中STAT6蛋白質(zhì)磷酸化 通過(guò)Western blot檢測(cè)THP-1細(xì)胞中STAT6蛋白質(zhì)及其磷酸化水平(圖7),在人單核巨噬細(xì)胞THP-1中,相對(duì)于LV-NC組,過(guò)表達(dá)IL-37的LV-37組顯著促進(jìn)STAT6蛋白質(zhì)磷酸化(P<0.001)。

A:Control group;B:IL-37 group;C:H/R group;D:H/R + IL-37 group.

圖4 H/R狀態(tài)下IL-37誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)L02細(xì)胞凋亡的影響

Fig 4 Apoptosis of L02 cells co-cultured with IL-37 drived THP-1 cells following H/R

圖5 H/R狀態(tài)下IL-37誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)L02細(xì)胞上清液中ALT、AST水平的影響

A:Control group;B:IL-37 group;C:H/R group;D:H/R+IL-37 group.

圖6 L02細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(HE,100×)

Fig 6 Morphology change of L02 cells (HE,100×)

圖7 IL-37對(duì)人單核巨噬細(xì)胞THP-1中STAT6蛋白質(zhì)及其磷酸化水平的影響

討 論

缺血再灌注(ischemic/reperfusion,I/R)由短暫性缺血伴隨再灌注造成,是各種病理狀況(如栓塞、中風(fēng)、休克、外科手術(shù)和器官移植等)期間器官損傷的關(guān)鍵機(jī)制。再灌注早期產(chǎn)生的活性氧和氮物質(zhì)引發(fā)的炎性反應(yīng)是造成細(xì)胞損傷的重要因素[10]。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞,在炎性反應(yīng)介導(dǎo)的HIRI中起到了怎樣的作用,又有何機(jī)制對(duì)其進(jìn)行調(diào)控仍待進(jìn)一步研究。IL-37作為一種抗炎因子,其對(duì)腦、腎、心I/R損傷的保護(hù)作用已有報(bào)道[11-12],但是IL-37通過(guò)影響巨噬細(xì)胞極化對(duì)HIRI的保護(hù)作用及其機(jī)制在國(guó)內(nèi)外卻鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究以H/R處理共培養(yǎng)的THP-1和L02模擬肝缺血再灌注模型,探討IL-37對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響及其對(duì)HIRI的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1) M2型巨噬細(xì)胞中IL-37 mRNA及蛋白質(zhì)水平上調(diào);(2) IL-37促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化;(3) IL-37誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞在H/R狀態(tài)下提高肝細(xì)胞存活率;(4) IL-37誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞在H/R狀態(tài)下降低肝細(xì)胞凋亡率;(5) IL-37誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞在H/R狀態(tài)下降低ALT、AST水平;(6) IL-37促進(jìn)THP-1細(xì)胞中STAT6蛋白質(zhì)磷酸化。本研究證明IL-37能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化,進(jìn)而在H/R狀態(tài)下抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞炎性反應(yīng),從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用,而IL-37對(duì)巨噬細(xì)胞極化的誘導(dǎo)作用可能與STAT6磷酸化激活有關(guān)。

IL-37是近年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子,屬于IL-1家族,主要作為抗炎因子調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。既往研究證明,IL-37主要通過(guò)兩種不同的機(jī)制發(fā)揮抗炎作用。其一是IL-37與IL-18Rα/SIGIRR結(jié)合,參與多種炎癥相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控從而起到抗炎作用[7,13]。其二則是通過(guò)與SMAD3結(jié)合抑制一些炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的合成和釋放[14-15]。此外,有研究證實(shí),LPS可增加IL-37 mRNA轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性并增加其蛋白質(zhì)水平[16]從而發(fā)揮更強(qiáng)的抗炎作用。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)藥物誘導(dǎo)極化的M2型巨噬細(xì)胞與M0型比較,IL-37表達(dá)顯著上調(diào),這提示IL-37可能與巨噬細(xì)胞M2型極化密切相關(guān)。同時(shí),與M0型巨噬細(xì)胞比較,M1型巨噬細(xì)胞中IL-37的蛋白質(zhì)水平也有一定上調(diào),這可能與LPS增加其轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性相關(guān)。

iNOS、CD86是M1型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記物[17],同時(shí),ARG1、CD206和CD163是M2型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記物[18]。本研究發(fā)現(xiàn),IL-37過(guò)表達(dá)的巨噬細(xì)胞在H/R狀態(tài)下,CD206、CD163和ARG1的表達(dá)顯著高于對(duì)照組,CD86和iNOS的表達(dá)顯著低于對(duì)照組,提示IL-37在H/R狀態(tài)下促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化并抑制了M1型極化。

細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞存活率和ALT、AST活力以及細(xì)胞形態(tài)變化[19]是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞損傷情況的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn),在H/R狀態(tài)下L02細(xì)胞的存活率顯著降低,同時(shí)凋亡率及細(xì)胞上清液中ALT、AST活力顯著提高,提示L02細(xì)胞在H/R狀態(tài)下受到嚴(yán)重?fù)p傷。然而,與過(guò)表達(dá)IL-37的THP-1源性巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)能夠顯著提高H/R狀態(tài)下L02的存活率,降低凋亡率及細(xì)胞上清液中ALT、AST活力,提示IL-37誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞可能對(duì)L02細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)IL-37的細(xì)胞中,pSTAT6水平較對(duì)照組顯著上調(diào),提示STAT6的磷酸化激活可能與IL-37的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。已有研究證明,STAT6信號(hào)通路參與巨噬細(xì)胞M2型極化的調(diào)控[20]。因此,我們猜測(cè)IL-37對(duì)巨噬細(xì)胞M2型極化的調(diào)控可能與STAT6的磷酸化激活有一定聯(lián)系,為IL-37調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化提供了可能的理論依據(jù)。

綜上所述,本研究證明了IL-37能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化,并通過(guò)構(gòu)建共培養(yǎng)條件下的細(xì)胞H/R損傷模型證明了IL-37誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞能夠在H/R狀態(tài)下對(duì)肝細(xì)胞起保護(hù)作用,初步解釋了IL-37調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化的可能機(jī)制。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,我們計(jì)劃增加動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及STAT6通路相關(guān)實(shí)驗(yàn),以探究IL-37誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化的確切機(jī)制及其在HIRI過(guò)程中的保護(hù)作用。

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IL-37 protects hepatocyte injury against hypoxia/reoxygenation by promoting polarization of M2-type macrophages

ZHU Di1, LI Ting-ting1, CHEN Qing-song1, MOU Tong1, TANG Cheng-yong2△

(1DepartmentofHepatobiliarySurgery,2DepartmentofPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To investigate the protective effect of IL-37 on hepatocyte injury against hypoxia/reoxygenation (H/R) by promoting polarization of M2-type macrophages and its molecular mechanisms. Methods Real-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR) and Western blot were used to detect the levels of IL-37 mRNA and protein in human monocyte-macrophage THP-1 cells with different polarizations.The lentivirus withIL-37 gene was infected into THP-1 cells.The levels of CD206,CD86,ARG1 and iNOS mRNA was detected by qRT-PCR.The levels of CD163 and CD86 protein was detected by flow cytometric analysis.THP-1 cells and L02 cells were co-cultured by Transwell and treated with H/R.The survival rate and apoptotic rate of L02 cells were detected.The levels of alanine transaminase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in culture medium were

measured.The levels of STAT6 and its phosphorylation in THP-1 cells were detected by Western blot.Results The levels of IL-37 mRNA and protein were up-regulated in M2-type macrophages.IL-37 promoted the polarization of M2-type macropahges.M2-type macrophages induced by IL-37 were co-cultured with L02 cells,the survival rate was significantly increased by H/R treatment (P=0.015),while the apoptotic rate,ALT level and AST level were significantly decreased (P<0.001).The level of phosphorylated STAT6 in THP-1 cells overexpressing IL-37 was up-regulated (P<0.01).Conclusions IL-37 can induce polarization of M2-type macrophages and protect hepatocyte injury against H/R.Its mechanism may be related to STAT6 signal pathways.

IL-37; macrophages; hypoxia/reoxygenation; hepatocyte injury

R575,R364.4,R392-33

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.010

2017-03-15;編輯:王蔚)

重慶市科委基金(CSTC2015shmszx120019)

△Corresponding author E-mail:wzjtcy@126.com

* This work was supported by the Foundation of Chongqing Science and Technology Commission (CSTC2015shmszx120019).