葉 華，周 芬，劉德伍，付尚峰，李夢蕓，李勇鐵

蛋白激酶C抑制劑GF109203X誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞去分化形成表皮干細(xì)胞的初步研究

葉 華，周 芬，劉德伍，付尚峰，李夢蕓，李勇鐵

目的 探討蛋白激酶C（PKC）抑制劑GF109203X誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞去分化形成表皮干細(xì)胞的可能性。方法 采用酶消化法結(jié)合Ⅳ型膠原快速貼壁法獲得人原代表皮干細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測GF109203X誘導(dǎo)培養(yǎng)后角質(zhì)形成細(xì)胞的表型及功能改變。同期分離培養(yǎng)的人在體表皮干細(xì)胞作為本次實(shí)驗(yàn)的陽性對照，原代角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)2 d后加等體積二甲基亞砜為陰性對照。結(jié)果 表皮干細(xì)胞快速黏附，培養(yǎng)4 d后細(xì)胞呈圓形，形態(tài)規(guī)則，折光性強(qiáng)，明顯克隆，β1整合素、CK19及CK14呈陽性表達(dá)，CK10陰性表達(dá)；已分化角質(zhì)形成細(xì)胞不能快速黏附，培養(yǎng)4 d細(xì)胞呈類圓形，大小不一，折光性較差，無明顯克隆，β1整合素、CK19及CK14呈陰性表達(dá)，CK10呈陽性表達(dá)。角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)GF109203X誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d后，實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組細(xì)胞群β1整合素、CK19、CK14均呈陽性表達(dá)，但實(shí)驗(yàn)組較陽性對照組中細(xì)胞β1整合素、CK19、CK14陽性細(xì)胞數(shù)少，CK10均呈陰性表達(dá)；陰性對照組中細(xì)胞群β1整合素、CK19及CKl4呈陰性表達(dá)，CKl0呈陽性表達(dá)。結(jié)論 GF109203X能夠誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞去分化形成表皮干細(xì)胞。

角質(zhì)形成細(xì)胞；去分化；蛋白激酶C抑制劑；表皮干細(xì)胞

[J Pract Dermatol, 2017, 10(3):132-135]

去分化又稱逆分化，是指已分化成熟的細(xì)胞和組織倒退分化，返回原始幼稚的狀態(tài)，也就是細(xì)胞沿著與發(fā)育相反的方向從相對高分化的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榈头只臓顟B(tài)，已分化成熟的終末細(xì)胞也可以轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹只瘽撃艿母杉?xì)胞[1]。最近研究表明，miR-203被稱為是皮膚特異性miRNA，與皮膚發(fā)育及其增殖分化特性改變密切相關(guān)。本課題組前期研究證實(shí)miR-203在表皮干細(xì)胞中表達(dá)明顯低于角質(zhì)形成細(xì)胞[2]，而miR-203的表達(dá)依賴于蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路的激活[3]。抑制PKC活性是否對角質(zhì)形成細(xì)胞去分化有影響，目前少見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以人角質(zhì)形成細(xì)胞為研究對象，初步探討PKC特異性抑制劑GF109203X誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞去分化形成表皮干細(xì)胞的可能性，為進(jìn)一步采用非轉(zhuǎn)基因方法誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞去分化形成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

濕法浮選脫炭是山東煤機(jī)裝備集團(tuán)利用新型高效浮選工藝進(jìn)行脫炭的一種方法。由于殘余的炭粒子是高度分散的疏水性顆粒，當(dāng)粉煤灰漿體中加入浮選劑后，一方面，浮選劑與煤粒的親和力比灰強(qiáng)；另一方面，由于浮選劑是一種異極性物質(zhì)，能改變水中煤粒表面濕潤性，使炭粒表面疏水性增強(qiáng)，從而附著于氣泡上浮到水面，而使煤和灰分離，分別經(jīng)濃縮、脫水后即得到有用的精煤和濕粉煤灰。濕粉煤灰經(jīng)烘干、分選、粉磨之后，即得到優(yōu)質(zhì)粉煤灰。浮選廢液循環(huán)利用。

包皮標(biāo)本取材于2014年3—6月在本院泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)的青年男性，年齡16～30歲，所有取材經(jīng)患者知情同意。

1.2.1 主要儀器與試劑 Sw-CJ-1F無菌超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；CX40型普通光學(xué)顯微鏡，Leica CTR6000熒光倒置相差顯微鏡，二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Anke TDL-50B自動平衡離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造廠）。PKC抑制劑GF109203X購自美國Selleck公司，Ⅳ型膠原、DMSO購自Sigma公司，角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基Defined K-SFM、0.25%胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清購自美國Gibco公司，鼠抗人β1整合素（1:100）、CK19（1:100）、CK14（1:100）、CK10（1:100）購自美國Abgent公司，PV-9000二步法免疫組化檢測試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中山金橋生物技術(shù)公司，PBS、D-HANK'S液購自美國Solarbio公司。

1.2 方法

利用測井資料的全部頻率成分對地震時(shí)間剖面進(jìn)行分析，補(bǔ)充了地震數(shù)據(jù)中缺失的低頻成分，使得反演結(jié)果的分辨率可以突破地震分辨率的限制。該技術(shù)能夠把地震資料與測井資料有機(jī)地結(jié)合起來，充分發(fā)揮地震橫向分辨率高、測井在縱向上分辨率高的優(yōu)勢，將一般意義上的地震資料轉(zhuǎn)換成與地層巖性信息密切相關(guān)的巖性地質(zhì)剖面，便于進(jìn)行儲層預(yù)測。

倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種時(shí)實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組角質(zhì)形成細(xì)胞呈類圓形，大小不一，折光性較差。陽性對照組表皮干細(xì)胞分散較均勻，細(xì)胞呈圓形，形態(tài)規(guī)則，折光性強(qiáng)。孵育2 d后實(shí)驗(yàn)組（圖1a）與陰性對照組（圖1b）未見明顯細(xì)胞克隆，細(xì)胞貼壁不牢固，細(xì)胞數(shù)量減少；陽性對照組（圖1c）可見部分細(xì)胞克隆，細(xì)胞聚集成團(tuán)。GF109203X誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d后，實(shí)驗(yàn)組（圖2a）部分細(xì)胞形成克隆，貼壁牢固；陰性對照組

1.2.3 PKC抑制劑GF109203X誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞去分化形成表皮干細(xì)胞 將角質(zhì)形成細(xì)胞分為PKC抑制劑實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組，表皮干細(xì)胞組為陽性對照組。分別于分離培養(yǎng)2 d后換液，吸出培養(yǎng)基，1%雙抗D-HANK'S沖洗3遍，實(shí)驗(yàn)組加含10 μmol/L GF109203X的Defined K-SFM培養(yǎng)基，陰性對照組加含同等劑量DMSO (4.1 μl) 的Defined K-SFM培養(yǎng)基，陽性對照組常規(guī)換液。37℃、5% CO2、飽和濕度孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)基，并觀察細(xì)胞的生長情況。

1.2.2 在體表皮干細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的分離與培養(yǎng) ①Ⅳ型膠原包被培養(yǎng)皿的制備：Ⅳ型膠原溶于體積分?jǐn)?shù)為0.1%的醋酸溶液至終濃度為100 mg/L，濾過除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?張直徑25 mm蓋玻片放入直徑60 mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)前40 min用配制好的Ⅳ型膠原溶液1～2 ml平鋪其中，超凈工作臺內(nèi)吹干。②表皮干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：采用胰蛋白酶消化法分離表皮，Ⅳ型膠原快速黏附法分離人表皮干細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞[4]。分別在由表皮生長因子、Defined K-SFM等組成的培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析 各組細(xì)胞培養(yǎng)4 d后，吸去培養(yǎng)基，從培養(yǎng)皿中取出細(xì)胞爬片，PBS洗3次，每次5 min，4℃冰丙酮固定30 min，風(fēng)干后PBS洗3次，每次5 min，0.3%TritonX-100破膜20 min，3%H2O2去離子水室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS洗3次，每次2 min。5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗。每張爬片滴加50 μl一抗（鼠抗人β1整合素、CK19、CK14、CK10，每次實(shí)驗(yàn)完成一個(gè)指標(biāo)的測定），4℃孵育過夜，并分別設(shè)置PBS對照，PBS洗3次，每次2 min。滴加試劑1各50 μl，37℃孵育20 min，PBS洗3次，每次2 min；滴加試劑2各50 μl，37℃孵育20～30 min，PBS洗3次，每次2 min。DAB顯色，自來水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。

3）同時(shí)在管道的兩端安裝配件是很好的操作。如果不能實(shí)現(xiàn)，只拆開配件包裝的一端，將配件安裝到管端?？蓪b袋固定，將暴露的配件端遮蓋住，使配件孔不受污染。

2 結(jié)果

2.1 GF109203X對角質(zhì)形成細(xì)胞表型變化的影響

1.2.1 PKC抑制劑GF109203X的配制 PKC抑制劑GF109203X瓶裝粉劑1 mg，充分溶解于200 μl DMSO，終濃度為10 μmol/L；分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。誘導(dǎo)前將分裝的PKC抑制劑GF109203X 4.1 μl與Defined K-SFM混合配成5 ml備用。

去分化是一個(gè)由核酸、酶、蛋白質(zhì)等多層次調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與的復(fù)雜生物學(xué)過程[5]。胚胎干細(xì)胞的自我更新基因Oct-4、Sox2、Nanog[6-8]，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Klf4[9]及原癌基因c-myc[10]等均被報(bào)道與細(xì)胞去分化的調(diào)控密切相關(guān)。大量研究表明，去分化現(xiàn)象在不同等級的生物中普遍存在，只是表現(xiàn)水平不同而已。

免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞群β1整合素、CK19、CK14呈棕黃色陽性表達(dá)，而CK10染色未見明顯陽性表達(dá)，具有表皮干細(xì)胞特征。陰性對照組細(xì)胞群β1整合素、CK19、CK14呈棕黃色陰性表達(dá)，而CK10陽性表達(dá)，符合角質(zhì)形成細(xì)胞特征。陽性對照組細(xì)胞群β1整合 素、CK19、CK14呈棕黃色陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目較實(shí)驗(yàn)組更多，CK10陰性表達(dá)（圖3-圖6）。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

線形生產(chǎn)建設(shè)項(xiàng)目產(chǎn)生的水土流失多發(fā)生在建設(shè)期，主要是臨時(shí)堆土堆渣區(qū)和線路穿越區(qū)等。線形生產(chǎn)建設(shè)項(xiàng)目一般線路長達(dá)幾百甚至幾千公里，有些會跨越很多無人區(qū)或人跡罕至區(qū)，施工單位容易產(chǎn)生僥幸心理，因而在施工時(shí)圖方便而肆意破壞植被的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。

3) 凸輪偏心率mb越大，則ψ、ψ、ψ、μ的最大絕對值越大(圖2和表1)，γ、λ、σ、β的最大絕對值越大(式(8)和式(18))，Γm、Λm、Σm、Tm的值越大(式(19))，從而機(jī)構(gòu)動力學(xué)性能越差。因此mb值不宜過大。

3 討論

（圖2b）細(xì)胞較前數(shù)量減少，未見明顯細(xì)胞克隆，貼壁不牢固。陽性對照組（圖2c）細(xì)胞常規(guī)換液，細(xì)胞形成明顯克隆，貼壁牢固。

圖1 接種2 d后表皮干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（倒置相差微鏡×100）

圖2 GF109203X誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d后表皮干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（倒置相差微鏡×100）

圖3 GF109203X誘導(dǎo)培養(yǎng)后角質(zhì)形成細(xì)胞β1整合素表達(dá)變化（SP法×100）

圖4 GF109203X誘導(dǎo)培養(yǎng)后角質(zhì)形成細(xì)胞CK19表達(dá)變化（SP法×100）

圖5 GF109203X誘導(dǎo)培養(yǎng)后角質(zhì)形成細(xì)胞CK14表達(dá)變化（SP法×100）

圖6 GF109203X誘導(dǎo)培養(yǎng)后角質(zhì)形成細(xì)胞CK10表達(dá)變化（SP法×100）

表皮干細(xì)胞（epidermal stem cells，ESCs）是皮膚組織特異性干細(xì)胞，增殖能力強(qiáng)，可以增殖分化為各種角質(zhì)形成細(xì)胞，具有維持表皮自我更新、保持正常表皮結(jié)構(gòu)以及促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)等作用[11,12]。它的多向分化潛能在皮膚組織工程學(xué)中有著誘人的應(yīng)用前景，是構(gòu)建組織工程皮膚的重要種子細(xì)胞。表皮干細(xì)胞的表面標(biāo)志是其分離鑒別的關(guān)鍵，目前常用的標(biāo)志物有整合素、角蛋白、p63、p75EL角質(zhì)形成細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體CD71等。其中角蛋白是角質(zhì)形成細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，隨著細(xì)胞分化程度表達(dá)不同，可用于鑒別表皮干細(xì)胞、短暫擴(kuò)增細(xì)胞及終末細(xì)胞。目前干細(xì)胞在皮膚組織中含量很少，尤其大面積皮膚缺損的患者，表皮干細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，這大大限制了其臨床應(yīng)用。研究表明利用角質(zhì)形成細(xì)胞去分化途徑來制造表皮干細(xì)胞，可以作為機(jī)體自身來源表皮干細(xì)胞的替代細(xì)胞應(yīng)用于皮膚損傷重建和再生的相關(guān)研究[13]。若能將角質(zhì)形成細(xì)胞逆向分化為表皮干細(xì)胞，可為皮膚組織工程提供豐富來源的種子細(xì)胞，為臨床急、慢性創(chuàng)面和瘢痕的修復(fù)治療帶來新的希望。

表皮干細(xì)胞的終末分化是一個(gè)需要協(xié)調(diào)的基因表達(dá)程序的多步驟過程。宋志芳等[2]采用miRNA芯片檢測技術(shù)比較表皮干細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞miRNA的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)153個(gè)miRNA明顯下調(diào)，而miRNA-203在表皮干細(xì)胞中下調(diào)最顯著，31個(gè)miRNA在表皮干細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，靶基因預(yù)測提示miRNA與細(xì)胞的增殖和分化、凋亡和衰老等生物學(xué)特性變化密切相關(guān)。Yi等[14]發(fā)現(xiàn)miRNA-203通過限制表皮干細(xì)胞增殖潛能、誘導(dǎo)其退出細(xì)胞周期，從而促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分化，下調(diào)miRNA-203則抑制細(xì)胞分化。miRNA-203上調(diào)誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞的分化依賴PKC/AP-1通路的激活，這一過程可被PKC特異性抑制劑GF109203X阻斷[2]。

目前認(rèn)為PKC至少有12種亞型，通常分為3類：①鈣依賴型或經(jīng)典型PKC（classical，cPKCs）：由α、β1 、β2 、γ組成，激活時(shí)需依賴Ca2+，二酰甘油（DG）和磷脂酰絲氨酸（PS）或佛波酯（PMA）；② 鈣不敏感型或新型PKC（novel，nPKCs）：由δ，ε，η和θ組成，它不需要Ca2+，但需要DG、PS或PMA；③非典型PKC（a typical，aPKCs）：由ξ、λ、τ組成，僅需磷脂類物質(zhì)激活而不依賴Ca2+、DG及PMA。GF109203X是一個(gè)高選擇性的PKC抑制劑，其與PKCα、PKCβ1、PKCβ2及PKCγ結(jié)合后，競爭性抑制ATP與PKC的結(jié)合，從而高度抑制PKC的活性，導(dǎo)致PKC功能顯著降低。

本研究實(shí)驗(yàn)組采用GF109203X終濃度為10 μmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)原代角質(zhì)形成細(xì)胞48 h后，部分細(xì)胞形成克隆，呈圓梭形，核漿比大，貼壁牢固；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞群β1整合素、CK19、CK14呈棕黃色陽性表達(dá)，而CK10染色未見明顯陽性表達(dá)，具有表皮干細(xì)胞特征。這可能與GF109203X抑制PKC活性，阻斷miRNA-203上調(diào)依賴的PKC/AP-1通路使miRNA-203表達(dá)下調(diào)有關(guān)，從而使角質(zhì)形成細(xì)胞逆分化為表皮干細(xì)胞。陰性對照組以DMSO替代F109203X，排除了溶媒導(dǎo)致假陽性結(jié)果的可能。然而這些細(xì)胞的功能與安全性仍有待研究，GF109203X誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞逆分化為表皮干細(xì)胞相關(guān)機(jī)制也還需要進(jìn)一步的深入研究。

基層黨群工作要從基層黨支部建設(shè)、思想政治工作和創(chuàng)新工作機(jī)制等方面入手。通過加強(qiáng)思想建設(shè)、組織建設(shè)、作風(fēng)建設(shè)、廉政建設(shè)、班子建設(shè)等方面的建設(shè)統(tǒng)一思想認(rèn)識，從而發(fā)揮出黨支部的戰(zhàn)斗堡壘作用。

GF109203X能夠誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞去分化形成表皮干細(xì)胞，為角質(zhì)形成細(xì)胞去分化形成表皮干細(xì)胞提供了一條非轉(zhuǎn)基因途徑，促使我們?nèi)ニ伎家环N新的創(chuàng)傷愈合機(jī)制，從而提高皮膚組織內(nèi)源性的再生能力，實(shí)現(xiàn)皮膚創(chuàng)傷由解剖修復(fù)到功能修復(fù)提供新的思路。

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A preliminary experimental study on dedifferentiation of epidermal keratinocytes into epidermal stem cells induced by protein kinase C inhibitor GF109203X

YE Hua，ZHOU Fen，LIU De-wu，et al

Institute of Burns, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China

Objective To investigate the feasibility of dedifferentiation of epidermal keratinocytes into epidermal stem cells induced by protein kinase C inhibitor GF109203X. Methods Human primary epidermal stem cells and epidermal keratinocytes were obtained by enzyme digestion method and typeⅣcollagen coated chosen method. The cells were divided into 3 groups as follow: experimental group: primary epidermal keratinocytes were cultured for 2 days before treated with GF109203X, of which the final concentration was 10 μM; negative controlled group: the same volume of DMSO was given instead of GF109203X as in experimental group; positive controlled group: human primary epidermal stem cells cultured in the same period without any intervention except for changing medium every other day. Growth of the cells cultured in vitro was observed by inverted microscope. Monoclonal antibody of integrinβ1, keratin 19 (CK19), CK14, and CK10 were detected by immunocytochemical staining. Results Epidermal stem cells exhibited rapid adherence to typeⅣ collagen, the morphology of the cells was round, which had refractivity and formed distinct clones after 4 days culture, the expressions of integrinβ1, CK19 and CK14 were positive. Epidermal keratinocytes could not adhere rapidly to typeⅣ collagen, the morphology of the cells was close round, with different size, which had no refractivity and formed few clones after 4 days culture, the expression of CK10 was positive. Immunocytochemical staining showed that the expressions of integrinβ1, CK19 and CK14 were positive in experimental group and negative in negative controlled group, but the former exhibited less positive cells after being treated with GF109203X for 2 days, for the both of the two groups, CK10 expression was negative. Positive controlled group showed the opposite result: the expressions of integrinβ1, CK19 and CK14 were negative and CK10 was positive. Conclusion GF109203X may induce the epidermal keratinocytes to convertinto epidermal stem cells, which provide a nontransgenic approach for dedifferentiation of epidermal keratinocytes into epidermal stem cells. On the other hand, the result of the study may offer a new idea for dedifferentiation of epidermal keratinocytes into induced pluripotent stem cells (iPSC).

Keratinocytes epidermal；Dedifferentiation；Protein kinase C inhibitor；Epidermal stem cells

R329.2

A

1674-1293(2017)03-0132-04

2016-12-12

2017-05-13）

（本文編輯 耿建麗）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20170302

330006 南昌，南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷研究所（葉華，劉德伍，付尚峰，李夢蕓）；江西省贛州市人民醫(yī)院燒傷科（葉華）；江西省上饒縣婦幼保健院（周芬）；江西省吉安市中心人民醫(yī)院燒傷整形科（李勇鐵）

葉華，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：創(chuàng)面修復(fù)，E-mail: yuyan8902@qq.com

劉德伍，E-mail: dewuliu@126.com