張金玲，郭禮強(qiáng)，孫 軍，吳翠玲

(1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041；2.安捷倫科技(中國(guó))有限公司，北京 100102)

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液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血清和尿液中硝基咪唑類藥物殘留

張金玲1，郭禮強(qiáng)1，孫 軍1，吳翠玲2

(1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041；2.安捷倫科技(中國(guó))有限公司，北京 100102)

為建立血清和尿液中甲硝唑、羥基甲硝唑、二甲硝咪唑和羥基二甲硝咪唑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)快速測(cè)定方法，樣品用乙酸乙酯提取，經(jīng)PCX固相萃取柱凈化，Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)分離，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。結(jié)果表明，甲硝唑、羥基甲硝唑、二甲硝咪唑及羥基二甲硝咪唑在0.20 μg/L～50 μg/L范圍呈良好線性，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995，檢出限為0.20 μg/L，定量下限為0.50 μg/L。樣品在定量下限1、2、10倍3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為89.3%～108.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.63%～10.0%。該方法靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于血清和尿液中硝基咪唑類藥物的檢測(cè)分析。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；血清；尿液；殘留分析；硝基咪唑

硝基咪唑類藥物(nitromidazoles)是一類應(yīng)用廣泛的人工合成的具有5-硝基咪唑基本結(jié)構(gòu)的抗菌、抗原蟲藥物，甲硝唑(metronidazole)和二甲硝咪唑(dimetridazole)為硝基咪唑類常用的兩種，被廣泛應(yīng)用于殺滅及預(yù)防厭氧菌和病原蟲，也用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑來(lái)促進(jìn)雞、豬、牛等的生長(zhǎng),其在動(dòng)物體內(nèi)迅速被代謝成羥基甲硝唑和羥基二甲硝咪唑。然而，硝基咪唑類藥物具有致突變和致癌性[1]，其代謝物因同樣含有咪唑環(huán)而具有與原藥類似的毒性[2]。歐盟在96/23/EC歐盟理事會(huì)指令及EC2377/90[3]中將其列入A類禁用藥物，不得在任何食品中檢出。為防止二甲硝咪唑等致癌藥物在食源性動(dòng)物殘留對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，我國(guó)也于2002年禁用了該類藥物[4]。由于經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)和監(jiān)管手段的不足，違法企業(yè)常在動(dòng)物飼料和動(dòng)物疫病防治過(guò)程中使用硝基咪唑類藥物中的甲硝唑、地美硝唑(二甲硝咪唑)及其鹽、酯及制劑。因此，建立血清和尿液中甲硝唑和二甲硝咪唑及代謝物殘留量的分析方法，可以在屠宰前預(yù)知?jiǎng)游镌词称凤L(fēng)險(xiǎn)，增加了檢驗(yàn)檢疫行政執(zhí)法的手段。

目前，硝基咪唑類化合物的檢測(cè)方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[5]、液相色譜法[6-7]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-13]，氣相色譜-質(zhì)譜法的缺點(diǎn)是需要衍生化，液相色譜法的選擇性和靈敏度較差，具有高特異性和靈敏度的液相色譜-質(zhì)譜法是目前檢測(cè)硝基咪唑類藥物殘留的首選方法。本文應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)血清和尿液中甲硝唑和二甲硝咪唑及代謝物藥物殘留，該方法具有快速、高效、高靈敏度等特點(diǎn)，為政府監(jiān)管部門提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 甲硝唑、羥基甲硝唑、二甲硝咪唑、羥基二甲硝咪唑、氘代二甲硝咪唑及氘代羥基二甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；甲醇、乙酸乙酯、乙腈及甲酸均為色譜純，美國(guó)Biopure公司產(chǎn)品； 鹽酸和氨水為分析純，天津科密歐公司產(chǎn)品。

1.1.2 溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別配制甲硝唑、羥基甲硝唑、二甲硝咪唑、羥基二甲硝咪唑、氘代二甲硝咪唑及氘代羥基二甲硝咪唑終濃度均為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于0～4℃冰箱中保存。定容液：取80 mL 1 mL/L的甲酸水(V/V)，與20 mL乙腈混勻。

1.1.3 儀器設(shè)備 高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1260-6460),美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品;配電噴霧離子源(ESI)、離心機(jī)(5810R型),Eppendorf公司產(chǎn)品；氮吹儀(N-EVAP),Organomation Associates公司產(chǎn)品；純水機(jī)(Milli-Q),美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；萬(wàn)分之一天平(Mettler AE163)；混合型陽(yáng)離子交換柱(200 mg/6 mL)，Agilent公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

1.2.1.1 血清 準(zhǔn)確量取2 mL樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液40 μL，混勻后加入乙腈2 mL，渦混均勻，加入15 mL乙酸乙酯，2.0 g無(wú)水硫酸鎂，渦混均勻，10 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入另一50 mL聚丙烯離心管，殘?jiān)俅斡?5 mL乙酸乙酯渦混重復(fù)提取，合并提取液，氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.2.1.2 尿液 準(zhǔn)確量取4 mL樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入4 mL水，再加入內(nèi)標(biāo)工作溶液40 μL，混勻后加入15 mL乙酸乙酯渦混均勻，10 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入另一50 mL聚丙烯離心管，殘?jiān)俅斡?5 mL乙酸乙酯渦混重復(fù)提取，合并提取液，氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.2.2 凈化 用0.1 mol/L鹽酸25 mL溶解樣品，濾紙過(guò)濾。依次用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol/L鹽酸活化陽(yáng)離子交換柱，將上述溶解液全部過(guò)柱，依次用5 mL 0.1 mol/L鹽酸，5 mL甲醇淋洗， 5 mL洗脫溶液洗脫并收集，在40 ℃水浴上氮?dú)獯蹈?，? mL初始流動(dòng)相溶液渦旋溶解，過(guò)0.22 μm濾膜，供質(zhì)譜測(cè)定。

1.2.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.2.3.1 液相色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相A:甲酸水(1∶999,V/V)溶液；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫程序：0 min 20%流動(dòng)相B；3.0 min 40%流動(dòng)相B；4.0 min 90%流動(dòng)相B；4.1 min 20%流動(dòng)相B；6.0 min 20%流動(dòng)相B。進(jìn)樣體積：20μL。柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 大氣壓電噴霧電離源(ESI)，正離子電離模式；干燥氣：10 L/min；干燥溫度：350 ℃；噴霧氣：45 psi ；電子倍增器電壓：400 V；毛細(xì)管電壓：4 000 V；霧化氣壓力：275.8 Kpa(40 psi)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；甲硝唑和二甲硝咪唑及代謝物的部分質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 甲硝唑、二甲硝咪唑及代謝物的部分質(zhì)譜參數(shù)

注：*定量離子。

Note： *quantitative ion.

2 結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

分別配制500 μg/L的甲硝唑和二甲硝咪唑及代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，選用正離子模式掃描，優(yōu)化各化合物的毛細(xì)管電壓和碰撞能量，以響應(yīng)值最高的兩個(gè)碎片離子和母離子組成定量離子對(duì)和定性離子對(duì)，并進(jìn)行MRM參數(shù)的優(yōu)化，4種目標(biāo)物的部分質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，總離子流圖見(jiàn)圖1。

2.2 線性范圍、檢出限與定量下限

對(duì)4種目標(biāo)分析物質(zhì)量濃度在0.20 μg/L～50 μg/L之間的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，甲硝唑、羥基甲硝唑及羥基二甲硝咪唑以氘代羥基二甲硝咪唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，二甲硝咪唑以氘代二甲硝咪唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，各化合物定量離子與內(nèi)標(biāo)校正離子峰面積之比的平均值(y)對(duì)其質(zhì)量濃度 (x，μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.995。在血清和尿液中添加系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以信噪比(S/N)為3作為方法的檢出限(LOD)，以信噪比(S/N)為10作為方法的定量下限(LOQ)，甲硝唑和二甲硝咪唑及代謝物的LOD為0.20 μg/L，LOQ為0.50 μg/L。4種目標(biāo)分析物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量下限見(jiàn)表2。

2.3 回收率與精密度

在空白樣品中添加甲硝唑和二甲硝咪唑及代謝物定量下限1、2、10倍3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。以回收率結(jié)果表示方法準(zhǔn)確度，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示方法的精密度，每個(gè)水平平行測(cè)定6個(gè)樣品，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，甲硝唑和二甲硝咪唑及代謝物在3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率分別為89.3%～108.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.63%～10.0%。

3 討論

3.1 樣品提取條件的優(yōu)化

對(duì)于血液和尿液中硝基咪唑類藥物的提取，適宜的溶劑有有乙酸乙酯[4,12]、二氯甲烷、甲苯及一些混合提取劑。向空白血液和尿液中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使每種待測(cè)物濃度為20 ng/mL，分別用乙酸乙酯、二氯甲烷、甲苯進(jìn)行提取。結(jié)果表明，二氯甲烷對(duì)硝基咪唑類藥物的提取回收率在51.0%～56.4%之間，而乙酸乙酯和甲苯對(duì)4種藥物的提取率均超過(guò)了75%以上，證明乙酸乙酯和甲苯都可以作為提取溶劑，考慮到乙酸乙酯具有更好的環(huán)境和安全因素，更有利于分離，最終確定用乙酸乙酯作為提取溶劑。文獻(xiàn)報(bào)道硝基咪唑類藥物在堿性條件下有一定分解，同時(shí)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)分析物在正離子模式下質(zhì)譜響應(yīng)值更好，故本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了乙酸乙酯提取后在不同鹽酸比例下對(duì)目標(biāo)分析物提取效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的鹽酸比例并不能明顯的提高甲硝唑和二甲硝咪唑及代謝物的提取效率，所以最終選擇只使用乙酸乙酯提取。血清中較多的蛋白質(zhì)會(huì)干擾目標(biāo)化合物的分析，降低了質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度，應(yīng)該在前處理過(guò)程中除去。關(guān)于血液中蛋白質(zhì)的沉淀方法，使用較多的有鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，等電點(diǎn)沉淀法和金屬離子沉淀法等。但是，等電點(diǎn)沉淀法比較繁瑣，血樣較少時(shí)不利于操作處理；金屬離子沉淀法容易污染質(zhì)譜設(shè)備；鹽析法有一定的可逆性，而乙腈沉淀蛋白質(zhì)比較方便，規(guī)避了以上缺點(diǎn)，最終選用用乙腈來(lái)沉淀蛋白。

3.2 樣品凈化條件的優(yōu)化

乙酸乙酯提取液中依然含有一定量極性的雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪等脂溶性物質(zhì)，尤其是血清樣品，基質(zhì)成分比尿液復(fù)雜，為提高方法的靈敏度，本文選用混合型陽(yáng)離子交換柱凈化?？疾炝颂崛∫哼^(guò)MCX、PCX兩種凈化柱對(duì)目標(biāo)物回收率和穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)MCX和PCX凈化柱4種目標(biāo)分析物的平均回收率分別為93.2%和92.1%，因MCX和PCX凈化柱回收率差距不明顯，從性價(jià)比考慮最終選用PCX凈化柱。PCX柱屬于強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱，在水相偏酸的環(huán)境下對(duì)目標(biāo)物有更好的吸附效果，試驗(yàn)進(jìn)一步考察了甲酸、乙酸及鹽酸溶解目標(biāo)物經(jīng)PCX柱凈化對(duì)回收率的影響。提取液經(jīng)氮?dú)獯蹈?，分別用0.1 mol/L 的甲酸、乙酸及鹽酸溶解，經(jīng)PCX柱凈化后經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3種酸性溶液均能將目標(biāo)物回收率提高到80%以上，但鹽酸質(zhì)譜噪音低，靈敏度比甲酸及乙酸高20%以上，最終選用鹽酸溶液溶解。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 μg/L)中甲硝唑、二甲硝咪唑及代謝物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

化合物Compounds回歸方程Regressionequation相關(guān)系數(shù)/rCorrelationcoefficient線性范圍/(μg·L-1)Linearrange檢出限/(μg·L-1)Detectionlimit定量下限/(μg·L-1)Quantitativelimit甲硝唑Metronidazoley=0.335365x+0.1371720.99790.20～50.00.200.50羥基甲硝唑Hydeoxymetronidazoley=0.0497440x+0.0365450.99580.20～50.00.200.50二甲硝咪唑Dimetridazoley=0.486102x-0.48450.99830.20～50.00.200.50羥基二甲硝咪唑Hydeoxydimetridazoley=0.262000x-0.21100.99840.20～50.00.200.50

表3 檢測(cè)方法的添加精密度和平均回收率(n=6)

3.3 色譜分離條件的優(yōu)化

硝基咪唑類藥物及其代謝物是一類具有5-硝基取代咪唑雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，質(zhì)量數(shù)偏小，血清和尿液基質(zhì)復(fù)雜，色譜分離過(guò)程中干擾物較多，因此色譜優(yōu)化的關(guān)鍵在于提高目標(biāo)分析物和類似物的分離度。比較了甲醇和乙腈作為流動(dòng)相對(duì)甲硝唑和二甲硝咪唑及代謝物的影響，發(fā)現(xiàn)使用乙腈為流動(dòng)相4種目標(biāo)物的MRM的提取離子流圖峰型尖銳對(duì)稱，靈敏度更高，保留時(shí)間穩(wěn)定。硝基咪唑類藥物屬于堿性離子，甲酸的加入有助于促進(jìn)質(zhì)子離子化，提高分析靈敏度，試驗(yàn)對(duì)比了水相中加入1、2、4 mL/L 3種比例的甲酸溶液，質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)1 mL/L甲酸的加入可以提高目標(biāo)物的響應(yīng)值，再增加甲酸比例對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)值影響不明顯。

由于硝基咪唑類藥物具有性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低，既能殺滅及預(yù)防厭氧菌和病原蟲，也可以促進(jìn)禽畜類的生長(zhǎng)。因此，依然被一些違規(guī)養(yǎng)殖場(chǎng)作為抗菌藥物備選使用。然而藥物的使用會(huì)造成其在動(dòng)物組織中聚集，從而直接或間接地通過(guò)食物鏈的作用對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用，增加致突變和致癌性風(fēng)險(xiǎn)[11-12]。因此，硝基咪唑類藥物的殘留及其帶來(lái)的食品安全問(wèn)題已引起消費(fèi)者的廣泛關(guān)注。目前，在國(guó)內(nèi)關(guān)于硝基咪唑類藥物多殘留檢測(cè)方法的報(bào)道有很多，徐娟等[8]建立了采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)口腔衛(wèi)生用品(牙膏及漱口水)中甲硝唑、替硝唑、奧硝唑、二甲硝咪唑及洛硝唑的方法，該方法可靠、穩(wěn)定，可滿足口腔衛(wèi)生用品中硝基咪唑類藥物含量檢測(cè)與確證的需要。張鴻偉等[9]報(bào)道了采用液相色譜-四極桿/離子阱串聯(lián)質(zhì)譜建立了蜂蜜中痕量硝基咪唑類藥物( 甲硝噠唑、咯硝噠唑、二甲硝咪唑、異丙硝唑) 及其羥基代謝物( 2-羥甲基-1-甲基-5-硝基咪唑、羥基甲硝唑及羥基異丙硝唑) 殘留的快速測(cè)定方法。方法快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好、適用性強(qiáng)，檢測(cè)限量滿足國(guó)內(nèi)外相關(guān)法規(guī)要求，可有效用于實(shí)驗(yàn)室日常分析和殘留監(jiān)控檢測(cè)。郭菁等[14]建立了高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定水產(chǎn)品中硝基咪唑類獸藥甲硝噠唑、洛硝噠唑、迪美硝唑及其代謝物羥基甲硝唑、羥基二甲硝咪唑殘留量的分析方法。該方法操作快速、高效、定量重復(fù)性好，適用于水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)。孟茜等[15]建立了化妝品中16種抗真菌類化合物(克霉唑、聯(lián)苯芐唑、特比萘酚、酮康唑、伊曲康唑)及硝基咪唑類化合物(甲硝唑、異丙硝唑、苯酰甲硝唑、二甲硝咪唑、替硝唑、奧硝唑、特尼噠唑、洛硝噠唑、氯甲硝咪唑、4-硝基咪唑及塞克硝唑)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)的方法。該方法快速簡(jiǎn)便，適用于化妝品中抗真菌類和硝基咪唑類等16種抗生素含量的測(cè)定。目前尚未發(fā)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定血清和尿液中甲硝唑和羥基甲硝唑及兩者代謝物殘留量的報(bào)道，本文建立了血清和尿液中甲硝唑、羥基甲硝唑、二甲硝咪唑及羥基二甲硝咪唑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)方法。該方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以隨時(shí)對(duì)企業(yè)飼養(yǎng)的食用動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)控，降低檢測(cè)成本，為政府監(jiān)管部門提供技術(shù)支撐。

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[15] 孟 茜, 鄭 榮, 王 柯. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定化妝品中16種抗真菌類和硝基咪唑類化合物[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2016, 26(6):784-788.

Residue Determination of Nitroimidazoles in Sera and Urine by High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

ZHANG Jin-ling1,GUO Li-qiang1,SUN Jun1,WU Cui-ling2

(1.WeifangEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Weifang,Shandong,261041,China； 2.AgilentTechnologiesCo.LTDinChina,Beijing,100102,China)

A method for the determination of metronidazole,hydroxy metronidazole,dimetridazole and hydroxy dimetridazole in sera and urine by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was established.The target compounds were purified with solid phase extraction column of PCX after extraction by ethyl acetate.Then the samples was separated by an Eclipse Plus C18column(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)and analyzed by HPLC-MS/MS.The calibration curves were linear in the range of 0.2 μg/L-50 μg/L for metronidazole,hydeoxy metronidazole,dimetridazole and hydeoxy dimetridazole with correlation coefficient (r) more than 0.995.The LOD was 0.2 μg/L and the LOQ was 0.5 μg/L.The average recoveries (n=6) in feed samples at three spiked levels(1 times,2 times,10 times) ranged from 89.3%-108.2% with relative standard deviations (RSDs) of 2.63%-10.0%.The method was sensitive,convenient and accurate,and could satisfy the demand of detection and analysis of nitroimidazoles in serum and urine samples.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; serum; urine; residue analysis; nitromidazole

2016-11-16

山東出入境檢驗(yàn)檢疫局科研基金項(xiàng)目(SK201349)；濰坊市2015年科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015ZJ1101)

張金玲(1973-)，女，山東高密人，高級(jí)獸醫(yī)師，獸醫(yī)碩士，主要從事食品分析與檢測(cè)研究。

S859.7

A

1007-5038(2017)07-0056-06