曹明慧，趙鳳菊

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100000；2.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽(yáng) 110164)

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豬源大腸埃希菌磺胺類藥物主要耐藥基因的檢測(cè)與分析

曹明慧1，趙鳳菊2*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100000；2.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽(yáng) 110164)

為查明遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌磺胺類耐藥菌株中sul1、sul2及dfrA1 3種基因型的流行及分布情況，科學(xué)指導(dǎo)獸醫(yī)臨床合理用藥，為豬大腸埃希菌病的防控提供科學(xué)依據(jù),利用PCR技術(shù)對(duì)磺胺類耐藥菌株進(jìn)行了3種耐藥基因型的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)耐藥基因的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，27株磺胺類耐藥菌株中sul2的檢出率最高，為74.07%(20/27)；其次為sul1、dfrA1，檢出率分別為33.33%(9/27)、22.22%(6/27)，同時(shí)攜帶sul1、sul2和sul2、dfrA1兩種基因型的菌株均占11.11%(3/27)，同時(shí)攜帶sul1、sul2及dfrA1 3種基因型的菌株占14.81%(4/27)。表明遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌磺胺類耐藥菌株中sul2為主要流行的基因型，并且在遼寧不同地區(qū)普遍存在，是介導(dǎo)豬源大腸埃希菌對(duì)磺胺類藥物耐藥性的主要基因型，其次為sul1、dfrA1。

豬；大腸埃希菌；磺胺類藥物；耐藥基因；聚合酶鏈反應(yīng)

磺胺類藥物是廣譜抗菌藥，對(duì)革蘭陰性和革蘭陽(yáng)性細(xì)菌具有抑菌活性[1]，從20世紀(jì)30年代開(kāi)始，磺胺類藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人類和動(dòng)物細(xì)菌病及原蟲(chóng)感染的治療[2]。近年來(lái)，由于臨床抗生素的不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥現(xiàn)象普遍存在，尤其是多重耐藥現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重。目前，抗生素抗性已經(jīng)成一個(gè)嚴(yán)重的健康問(wèn)題，微生物感染率和抗微生物藥物耐藥性的增加導(dǎo)致需要開(kāi)發(fā)新型、有效的廣譜抗菌藥[3]，但新型抗生素及新療法的研發(fā)速度卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于耐藥菌株的產(chǎn)生速度，從而給人類和動(dòng)物的臨床治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，減少或延緩耐藥菌株的出現(xiàn)對(duì)于有效的臨床治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

從人和動(dòng)物分離的革蘭陰性菌包括大腸埃希菌對(duì)磺胺類藥物耐藥性的高發(fā)生率已經(jīng)被廣泛報(bào)道[4]。在對(duì)遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌耐藥性調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌對(duì)磺胺類藥物的耐藥率高達(dá)41.54%(27/65)。因此，為查明遼寧地區(qū)磺胺類藥物主要耐藥基因的流行及分布情況，本研究對(duì)27株磺胺類藥物耐藥的豬源大腸埃希菌用PCR方法對(duì)sul1、sul2及dfrA1基因進(jìn)行了檢測(cè)分析，為遼寧地區(qū)豬大腸埃希菌病的科學(xué)防控提供理論依據(jù)，也為獸醫(yī)臨床磺胺類藥物的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，從而減少或降低抗生素抗性對(duì)人類及動(dòng)物健康造成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 27株對(duì)磺胺類藥物耐藥的豬源大腸埃希菌由遼寧不同地區(qū)病死豬或患病豬的組織臟器、活豬糞便中分離得到，由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)分別為20130608、20130708；水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(MH)、藥敏紙片，杭州市天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)分別為140506、140506；DNAzol提取試劑，Invitrogen產(chǎn)品；PrimeSTAR○RHS DNA Polymerase with GD buffer、ExTaqDNA聚合酶、10×Ex-Taqbuffer、2.5 mmol/L dNTPs、DNA Marker 2 000、溴化乙錠，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其他為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.1.3 PCR擴(kuò)增引物 根據(jù)GenBank上登錄的sul1(AY655485.1)、sul2(CP010373.2)及dfrA1(JQ690541.1)基因序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA模板的制備 挑取18 h～24 h培養(yǎng)的培養(yǎng)物，用1 mL無(wú)菌生理鹽水制備成一定濃度的菌懸液。吸取200 μL菌懸液至1.5 mL Eppendorf管中，加入800 μL DNAzol提取試劑，混勻后4℃、12 000 r/min離心10 min。吸取900 μL上清，置于另一1.5 mL Eppendorf管中，加入500 μL無(wú)水乙醇，混勻后4℃、12 000 r/min離心5 min。棄上清，無(wú)菌水配制的750 mL/L乙醇洗滌2次，干燥后用40 μL無(wú)菌水溶解沉淀，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列

1.2.2 耐藥基因檢測(cè)體系 采用25 μL反應(yīng)體系，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶0.125 μL ，滅菌水16.375 μL，模板 2 μL。

1.2.3 基因測(cè)序檢測(cè)體系 采用50 μL反應(yīng)體系，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，2×PrimeSTAR GD buffer(Mg2+plus)25 μL， dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)8 μL，上、下游引物各1 μL(引物濃度為20 μmol/L)，模板5 μL，滅菌水補(bǔ)至50 μL。

1.2.4 PCR反應(yīng)條件 94℃ 5 min；94℃ 45 s，退火溫度(根據(jù)引物選擇合適退火溫度) 45 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定 選取7株sul1基因陽(yáng)性樣品、15株sul2基因陽(yáng)性樣品，將其PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，并與NCBI基因庫(kù)進(jìn)行序列同源性比較。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

27株磺胺類耐藥菌株通過(guò)PCR方法進(jìn)行sul1、sul2及dfrA1基因檢測(cè)(表2)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，有4株磺胺類耐藥菌未檢測(cè)出sul1、sul2及dfrA1基因。sul1總的檢出率為33.33%(9/27)，sul2總的檢出率為74.07%(20/27)，dfrA1總的檢出率為22.22%(6/27)；只攜帶1種基因型的菌株占48.15%(13/27)，同時(shí)攜帶sul1、sul2 兩種基因型和同時(shí)攜帶sul2、dfrA1兩種基因型的菌株均占11.11%(3/27)，同時(shí)攜帶sul1、sul2及dfrA1 3種基因型的菌株占14.81%(4/27)?；蛐蛃ul2在遼寧不同地區(qū)的耐磺胺類耐藥菌株中普遍存在，以遼西和遼北地區(qū)檢出率最高，為100%。其次為基因型sul1，雖然在遼寧不同地區(qū)的磺胺耐藥菌株中均有檢出，但檢出較低。基因型dfrA1在遼北地區(qū)未檢出，遼西地區(qū)檢出率最高，為50%(表3)。

表3 不同地區(qū)大腸埃希菌磺胺類藥物主要耐藥基因攜帶情況

2.2 耐藥基因的測(cè)序結(jié)果

將7份sul1基因陽(yáng)性樣品測(cè)序結(jié)果與NCBI基因庫(kù)中sul1基因的同源性分析發(fā)現(xiàn),7份樣品的同源性均為100%。16份sul2基因陽(yáng)性樣品測(cè)序結(jié)果與NCBI基因庫(kù)中sul2基因的同源性分析發(fā)現(xiàn),11份樣品的同源性為99%，5份樣品的同源性為100%。

3 討論

當(dāng)前，全球細(xì)菌耐藥性問(wèn)題仍以驚人的速度在加劇，但幾乎沒(méi)有成功用于治療的新藥物產(chǎn)生，很多曾經(jīng)可以用一種藥物治療的傳染病目前已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題[5]。細(xì)菌耐藥性特別是多重耐藥性的出現(xiàn)，不僅嚴(yán)重威脅著人類和動(dòng)物疾病的治療，同時(shí)也導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

磺胺類藥物具有與對(duì)氨苯甲酸(para-amino-benzoic acid，PABA)相類似的分子結(jié)構(gòu)，二者競(jìng)爭(zhēng)性抑制二氫葉酸合成酶的活性[6]，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)與繁殖。sul基因在不同臨床和環(huán)境分離菌株中存在，具有攜帶和傳播磺胺抗性的作用[7]。sul1、sul2及sul3是已知的質(zhì)粒編碼的磺胺耐藥基因，可產(chǎn)生二氫葉酸合成酶并誘導(dǎo)磺胺類藥物的抗性[8]。二氫葉酸還原酶利用NADPH還原二氫葉酸產(chǎn)生四氫葉酸，從而影響細(xì)菌核蛋白合成，dfrA1是二氫葉酸還原酶的一種。根據(jù)以往的研究，sul1、sul2基因在磺胺類耐藥分離株中同時(shí)存在，在丹麥從人類分離的大腸埃希菌中sul2基因的流行比sul1高[9]。在對(duì)遼寧地區(qū)sul1、sul2及dfrA1 3種基因型的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)存在的基因型略有差異。sul2的檢出率最高，其次是sul1和dfrA1，這與以往的研究結(jié)果一致。在遼寧地區(qū)sul2分布廣泛，是介導(dǎo)豬源大腸埃希菌對(duì)磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要基因型。雖然sul1和dfrA1兩種基因型的檢出率較低，但在遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌對(duì)磺胺類藥物耐藥性方面仍起著重要作用。

[1] Byrne-Bailey K G,Gaze W H,Kay P,et al.Prevalence of sulfonamide resistance genes in bacterial isolates from manured agricultural soils and pig slurry in the United Kingdom[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(2):696-702.

[2] Iqbal M S,Rahman M,Islam R,et al.Plasmid-mediated sulfamethoxazole resistance encoded by the sul2 gene in the multidrug-resistantShigellaflexneri2a isolated from patients with acute diarrhea in Dhaka,Bangladesh[J].PLoS One,2014,9(1):e85338.

[3] Hafez H N,EI-Gazzar A R.Synthesis and biological evaluation of N- pyrazolyl derivatives and pyrazolopyrimidine bearing a biologically active sulfonamide moiety as potential antimicrobial agent[J].Molecules,2016,21(9):pii:E1156.

[4] Labar A S,Millman J S,Ruebush E,et al.Regional dissemination of a trimethoprim-resistance gene cassette via a successful transposable element[J].PLoS One,2012,7(5):e19961.

[5] 李 秀,強(qiáng) 斌,徐正中,等.全基因組測(cè)序在細(xì)菌耐藥性分析中的應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2016,32(8):696-99.

[6] Wu S,Dalsgaard A,Hammerum A M,et al.Prevalence and characterization of plasmids carrying sulfonamide resistance genes amongEscherichiacolifrom pigs,pig carcasses and human[J].Acta Vet Scand,2010,52:47.

[7] Trobos M,Christensen H,Sunde M,et al.Characterization of sulphonamide-resistantEscherichiacoliusing comparison of sul2 gene sequences and multilocus sequence typing[J].Microbiology,2009,155(Pt 3):831-836.

[8] Arabi H,Pakzad I,Nasrollahi A,et al.Sulfonamide resistance genes (sul) M in extended spectrum beta lactamase (ESBL) and non-ESBL producingEscherichiacoliisolated from iranian hospitals[J].Jundishapur J Microbiol,2015,8(7):e19961.

[9] Trobos M,Jakobsen L,Olsen K E,et al.Prevalence of sulphonamide resistance and class 1 integron genes inEscherichiacoliisolates obtained from broilers,broiler meat,healthy humans and urinary infections in Denmark[J].Int J Antimicrob Agents,2008,32(4):367-369.

Detection and Analysis of Sulfonamides Resistance Genes inEscherichiacolifrom Swine

CAO Ming-hui1,ZHAO Feng-ju2

(1.InstituteofChineseVeterinaryDrugSupervision,Beijing,100000,China; 2.LiaoningPreventionandControlCenterofAnimalEpidemicDiseases,Shenyang,Liaoning,110164,China)

To find out the prevalence and distribution of sul1,sul2 and dfrA1 three genotypes ofEscherichiacolifrom swine in Liaoning area,and to guide the clinical rational use of drugs，and to provide scientific basis for prevention and treatment of swineE.coliinfections,three resistance genetypes of the drug resistant strains were detected by PCR technology.Through the detection of drug resistance genes,the detection rate of sul2 was the highest,which was 74.07% (20/27); Followed by sul1,dfrA1,the detection rates were 33.33% (9/27),22.22% (6/27); Simultaneously carrying the two genotypes of sul1,sul2 and sul2,dfrA1 for 11.11% (3/27); Simultaneously carrying three genotypes of sul1,sul2 and dfrA1 for 14.81% (4/27).Therefore,sul2 was main genotype,and commonly existed in different areas of Liaoning,it is the main genotype ofE.coliisolated from pigs to the drug resistance,followed by sul2,dfrA1 in Liaoning area.

swine;Escherichiacoli; sulfonamides; drug resistance gene; polymerase chain reaction

2016-11-04

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目項(xiàng)目(201402573)

曹明慧(1991-)，女，吉林人，碩士研究生，主要從事微生物檢測(cè)研究。*通訊作者

S852.612；S858.28

A

1007-5038(2017)07-0046-03