劉吉山，肖躍強(qiáng)，褚仁忠，于 雪，姚春陽(yáng)，苗立中，楊 慧，柳增善，沈志強(qiáng)*

(1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；3.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；4.陽(yáng)信縣畜牧獸醫(yī)局，山東陽(yáng)信 251800)

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蛋雞心包積水綜合征病原鑒定及組織滅活疫苗緊急免疫試驗(yàn)

劉吉山1,2，肖躍強(qiáng)2，褚仁忠4，于 雪3，姚春陽(yáng)2，苗立中2，楊 慧3，柳增善1*，沈志強(qiáng)2*

(1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；3.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；4.陽(yáng)信縣畜牧獸醫(yī)局，山東陽(yáng)信 251800)

2016年4月，山東蛋雞養(yǎng)殖規(guī)模25 000余只的雞場(chǎng)發(fā)生了一種高致死率傳染病，病死率15%以上。通過(guò)臨床癥狀觀察、病理剖檢、血凝試驗(yàn)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)、PCR檢測(cè)及血清型分析，確診該病為禽腺病毒Ⅰ群4型感染所致。無(wú)菌采集該養(yǎng)殖場(chǎng)病死雞肝臟，制備組織滅活疫苗，對(duì)雞群進(jìn)行緊急注射免疫，免疫接種后7 d，病死雞數(shù)量開(kāi)始逐漸下降，12 d后完全停止發(fā)病死亡，最終成功控制了該病。應(yīng)用制備的同源組織滅活疫苗緊急免疫雞群有效控制了禽腺病毒Ⅰ群4型的感染，為該病提供了一種可靠的防控措施。

心包積水綜合征；蛋雞；禽腺病毒Ⅰ群4型；組織滅活疫苗；緊急免疫

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，根據(jù)其群特異性抗原的不同，可將其可分為Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ 3個(gè)群[1]。禽腺病毒Ⅰ群4型(FAdV-4)引起的心包積水綜合征疫情首先于 1987年3月在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)發(fā)生。因此，該病又被稱(chēng)為“安卡拉病”[2]，其主要癥狀和病理癥候群為心包積水綜合征，隨后在印度、日本、澳大利亞、智利及加拿大等很多國(guó)家均有發(fā)生[3-8]。我國(guó)于2015年上半年首先在山東地區(qū)養(yǎng)殖的“817雜交肉雞”中大規(guī)模發(fā)生該病，病死率10%～80%不等，引起了較大恐慌；隨后在蛋雞、麻雞等其他品種中也相繼發(fā)生了類(lèi)似疫情[9-11]。蛋雞上該病的表現(xiàn)為急性死亡，病死率15%以上，病雞排黃綠色糞便、隨后轉(zhuǎn)為亞臨床病變，表現(xiàn)為零星死亡，病程很長(zhǎng)，有時(shí)長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月以上。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)急性死亡期的病死蛋雞進(jìn)行臨床癥狀、病理剖檢、病毒血凝試驗(yàn)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)、PCR檢測(cè)及血清型分析，確診該病為禽腺病毒Ⅰ群4型感染所致。通過(guò)制備病死雞肝臟組織滅活苗，對(duì)發(fā)病雞群及受威脅雞群注射組織滅活疫苗進(jìn)行緊急防疫，取得了理想的防控效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 山東某養(yǎng)殖蛋雞25 000余只的雞場(chǎng)，該雞場(chǎng)共2棟雞舍，每棟12 500只，其中1棟雞舍發(fā)生了疾病且死亡雞只約1 900只，雞群發(fā)病時(shí)60日齡。采集病死雞肝臟置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗(yàn)用動(dòng)物 SPF雞胚、30日齡SPF雞，濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 Gene JET Viral DNA/RNA Purification Kit、Gene JET PCR Purification Kit、DreamTaqGreen PCR Master Mix，Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)合成 采用文獻(xiàn)[12]發(fā)表的 FAdVⅠ亞群的hexon基因血清型分型引物，上游引物FAdV-F：CAARTTCAGRCAGACGGT，下游引物FAdV-R：TAGTGATGMCGSGACATCAT。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀與剖檢病變觀察 觀察發(fā)病雞群臨床癥狀表現(xiàn)，并對(duì)病死及臨死雞進(jìn)行剖檢，觀察病理學(xué)變化。

1.2.2 病料采集與處理 無(wú)菌采集病死雞肝臟組織，與滅菌生理鹽水以1∶5比例混合，用滅菌研磨器研磨成組織勻漿，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒分離及血凝試驗(yàn) 取1.2.2中處理的病料經(jīng)卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，之后收取直至168 h死亡雞胚并觀察病變，收集尿囊液；經(jīng)雞胚繼續(xù)傳至第3代，采用1.1.4所述引物PCR檢測(cè)病毒分離結(jié)果，并進(jìn)行雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。

1.2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 取1.2.3中收集的第3代尿囊液，接種30日齡SPF雞10只，胸部肌肉注射0.2 mL/只，連續(xù)觀察7 d，同時(shí)設(shè)5只雞注射生理鹽水作為對(duì)照，記錄結(jié)果。

1.2.5 病毒DNA提取 取1.1.1肝臟1 g，置于研缽內(nèi)研磨搗碎加入PBS 反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心10 min，取上清提取 DNA，提取方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定 以提取的 DNA為模板， 擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)體系：PCR Mix 12.5 μL、上、下游引物各1 μL、DNA 模板1.5 μL，最后加滅菌 ddH2O 補(bǔ)至 25 μL。PCR反應(yīng)條件： 95 ℃ 3 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，回收PCR產(chǎn)物，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，分析酶切位點(diǎn)以確定病毒血清型。

1.2.7 組織滅活苗的制備 無(wú)菌采集養(yǎng)殖場(chǎng)病死雞肝臟，按照組織∶鹽水1∶5 (w/v)比例高速勻漿后過(guò)濾，濾液中加入終濃度3 mL/L的甲醛溶液，置于37℃溫箱內(nèi)滅活24 h，并進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。同時(shí)接種10只1月齡雞，2 mL/只，觀察7 d后接種雞均健活為合格。加入等量生理鹽水混勻后分裝備用。

1.2.8 緊急免疫與治療 對(duì)發(fā)病和尚未發(fā)病的雞群分別胸部肌肉注射接種制備的組織滅活疫苗1 mL/只，同時(shí)給予雞群電解多維及維生素C等抗應(yīng)激藥物，連續(xù)觀察15 d，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀與剖檢病變

該病表現(xiàn)為急性發(fā)病，死亡約1 900只，病死率15%以上，病雞羽毛蓬亂、排黃綠色糞便，雞群呈現(xiàn)以病死雞為中心擴(kuò)散發(fā)病死亡，隨后轉(zhuǎn)為亞臨床癥狀，零星死亡，病程很長(zhǎng)，長(zhǎng)者達(dá)3個(gè)月以上。病死雞剖檢呈現(xiàn)明顯的心包積液，積液清亮淡黃色，有些病雞心包積液量達(dá)10 mL，肝臟腫大壞死，腎臟腫大，肌胃與腺胃交界處帶狀或點(diǎn)狀出血，腺胃乳頭出血。部分發(fā)病雞剖檢病變見(jiàn)圖1。

2.2 病毒分離結(jié)果

病料接種雞胚后雞胚在3 d～7 d內(nèi)死亡，個(gè)別雞胚7 d后仍未死亡。死亡雞胚胚體水腫、出血，肝臟出血、壞死，心臟心包有積液(圖2)。

A.心包積液；B.腺胃出血；C.肝臟病變A.Hydropericardium; B.Hemorrhage in glandular stomach; C.Gross lesions in liver

A.雞胚出血水腫；B.雞胚心包積液；C.雞胚肝臟病變A.Hemorrhage and edema in lethal embryo; B.Hydropericardium; C.Gross lesions in liver

2.3 血凝試驗(yàn)結(jié)果

收集死亡雞胚尿囊液，針對(duì)hexon基因的PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，用1%雞紅細(xì)胞檢測(cè)病毒血凝性，不能凝紅細(xì)胞，提示排除了新城疫病毒、禽流感病毒等有血凝性的病毒感染的可能性。

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

30日齡SPF雞注射收集的尿囊液后急性發(fā)病，2 d～4 d全部死亡，與雞場(chǎng)發(fā)病雞呈現(xiàn)高度相似的臨床癥狀與剖檢病變，表現(xiàn)為排黃綠色稀便，急性死亡，死前仍能吃料；死亡雞心包積液，腺胃與肌胃交界處有出血條帶。說(shuō)明采集的病料內(nèi)含有毒力強(qiáng)的

病原，經(jīng)雞胚傳代成功分離到病原。試驗(yàn)雞死亡情況如表1所示。

2.5 PCR擴(kuò)增與測(cè)序結(jié)果

擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，產(chǎn)物大小為885 bp，經(jīng)測(cè)序分析，擴(kuò)增序列中含有與FAdV-4型病毒一致的StyⅠ與MluⅠ酶切位點(diǎn)，且切割位置與切割產(chǎn)物大小與文獻(xiàn)報(bào)道一致，不含有BsiWⅠ、ScaⅠ、BglⅠ與AspⅠ等確定其他血清型病毒的酶切位點(diǎn)，BLAST序列比對(duì)，與已公布的FAdV-4型病毒序列同源性在99%以上。以上結(jié)果表明，所分離到的病原是1株FAdV-4型病毒。

表1 動(dòng)物回歸試驗(yàn)SPF雞死亡情況

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對(duì)照；2.病料樣品擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control; 2.Amplification products liver sample

圖3 PCR檢測(cè)電泳結(jié)果

Fig.3 PCR detection results of the infected laying hens

2.6 緊急免疫試驗(yàn)

緊急免疫之前發(fā)病雞舍(1號(hào)舍)已發(fā)病15 d，急性死亡期已經(jīng)過(guò)去，共死亡827只，目前每天死亡30余只，未發(fā)病舍(2號(hào)舍)已出現(xiàn)零星死亡，每天死亡3只～5只，死亡雞只剖檢后病變與1號(hào)舍的高度相似。緊急免疫治療結(jié)果顯示，剛注射后由于受到應(yīng)激刺激導(dǎo)致死亡率有所升高，1號(hào)舍由原來(lái)每天死亡30多只上升到40多只，2號(hào)舍由3只～5只升高到10多只，隨后死亡數(shù)逐漸下降，10多天后兩舍雞群均停止死亡，雞群逐漸恢復(fù)健康。緊急免疫后死亡情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 緊急免疫后雞群發(fā)病死亡情況

3 討論

Ⅰ群禽腺病毒目前已鑒定5個(gè)病毒種、12個(gè)血清型及鴨腺病毒、火雞腺病毒等暫定種[12]，可引起心包積水綜合征、包涵體肝炎及肌胃糜爛等臨床癥狀。心包積水綜合征又被稱(chēng)為“安卡拉病”，引起該病的毒株除了1例與FAdV-12共感染以外，絕大多數(shù)為FAdV-4血清型[13-14]。研究表明，F(xiàn)AdV-4毒株之間存在毒力差異，有的FAdV-4毒株本身就可以引起發(fā)病，有的則需要免疫抑制因素協(xié)同作用。本研究中，該雞場(chǎng)發(fā)生高死亡率傳染病，經(jīng)初步篩選，引起雞群高死亡率的疾病已知的有禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒以外，還有FADV-4感染，但從該雞群的發(fā)病癥狀及剖檢癥狀可以排除雞傳染性支氣管炎病毒感染；通過(guò)接種雞胚分離病毒和病毒血凝試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，死亡雞胚尿囊液均不凝集雞紅細(xì)胞，排除了具有血凝性的禽流感病毒、新城疫病毒感染致病的可能性。用分離的病毒接種SPF雞進(jìn)行動(dòng)物攻毒回歸試驗(yàn)，成功復(fù)制了與雞場(chǎng)高度相似的臨床癥狀與剖檢病變，并且致死性高達(dá)100%，確定了病料中含有高致死性傳染因子，并且成功分離到致病病原。據(jù)報(bào)道，PCR方法已經(jīng)被用于檢測(cè)Ⅰ亞群禽腺病毒，即使用六鄰體基因引物可區(qū)分病毒種并定位到特定血清型[15]。因此，本研究使用文獻(xiàn)報(bào)道的引物進(jìn)行PCR并進(jìn)行酶切位點(diǎn)序列分析，確診該雞場(chǎng)系感染了Ⅰ群禽腺病毒4型(FAdV-4)導(dǎo)致雞群發(fā)病死亡。

該病在臨床上可以分為兩個(gè)階段，急性發(fā)病期，在該階段死亡率明顯增高，隨后轉(zhuǎn)入慢性期，每天有雞星死亡，大部分病程長(zhǎng)達(dá)2個(gè)～3個(gè)月。該病既能水平傳播，也能垂直傳播，水平傳播主要是接觸性傳播，也可經(jīng)各種排泄物傳播，而糞便中病毒含量最高，有報(bào)道稱(chēng)雞舍內(nèi)的水平傳播主要是通過(guò)與糞便的直接接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)，并在短距離內(nèi)也通過(guò)空氣緩慢傳播，持續(xù)數(shù)周，這一現(xiàn)象在該發(fā)病雞場(chǎng)臨床發(fā)病與表現(xiàn)得到印證，即一旦雞群中有雞發(fā)病，該病會(huì)以發(fā)病雞為中心向周?chē)椛鋫鞑?，逐漸蔓延整個(gè)雞群，這也可能是該病流行慢，病程長(zhǎng)的原因。

已有報(bào)道通過(guò)制備肝組織滅活疫苗在預(yù)防心包積水綜合征上獲得顯著成效[16-17]。本研究制備同源組織滅活疫苗，對(duì)發(fā)病和未發(fā)病雞群進(jìn)行緊急防疫，發(fā)現(xiàn)在短時(shí)間內(nèi)成功控制了該病。說(shuō)明該疫苗不僅可以對(duì)發(fā)病雞群起到很好的治療作用，還能夠?qū)ξ窗l(fā)病雞群起到良好的預(yù)防作用。另外，該病在“817肉雞”中發(fā)病嚴(yán)重，對(duì)雞群也可以大劑量應(yīng)用卵黃抗體，通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，雖然治療效果確切，但容易復(fù)發(fā)，不適合在飼養(yǎng)期較長(zhǎng)的雞群應(yīng)用。本研究結(jié)果提示，同源組織滅活疫苗不僅能用于免疫預(yù)防，也可用于免疫治療，開(kāi)展該病的臨床防控。

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Pathogen Identification of Hydropericardium Syndrome and Contingency Vaccination with A Developed Tissue Inactivated Vaccine in Breeding Hens

LIU Ji-shan1,2,XIAO Yue-qiang2,CHU Ren-zhong4, YU Xue3,YAO Chun-yang2, MIAO Li-zhong2,YANG Hui3,LIU Zeng-shan1,SHEN Zhi-qiang2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin,130062,China; 2.ShandongBinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong,256600,China; 3.ShandongLvduBio-SciencesandTechnologyCo.Ltd.,Binzhou,Shandong,256600,China； 4.YangxinAnimalHusbandryandVeterinaryBureau,Yangxin,Shandong，251800，China)

In april 2016,a highly lethal infectious disease emerged in a farm of more than 25 000 breeding hens locating in Shandong province,and the mortality rate reached to 15%,which resulted in heavy economic losses.The disease was diagnosed through the clinical symptoms,autopsy lesions,hemagglutination test,PCR detection,serotype analysis and animal regression tests.The results showed that the fowl adenovirus type 4 (FAdV-4) was the agent of this disease.The livers of sick or dead chickens were collected and the tissue inactivated vaccine was developed,and all animals in this farm were performed contingency vaccination,7 days later,the number of sick hens began to decrease gradually,and there were no more infected animals at 12 day time point,so the disease was successfully controlled through the tissue inactivated vaccine immunization.This study provided a reliable measure for prevention and control of the epidemic disease with FAdV-4 infection through developing the homologous tissue inactivated vaccine and thereafter the contingency vaccination.

Hydropericardium syndrome; breeding hen; Fowl adenovirus serotype 4; tissue inactivated vaccine; contingency vaccination

2016-11-14

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-11-16)

劉吉山(1975-)，男，山東高唐人，副研究員，獸醫(yī)博士生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.1;S858.31

A

1007-5038(2017)07-0037-05