龐文靜，付明哲，許信剛，郭抗抗，張 琪

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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豬流行性腹瀉病毒陜西HZ株的分離與鑒定

龐文靜，付明哲，許信剛，郭抗抗*，張 琪*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

從陜西省某養(yǎng)豬場送檢的腹瀉仔豬小腸內(nèi)容物中分離到1株病毒，用Vero細(xì)胞盲傳至8代以后出現(xiàn)較為穩(wěn)定的CPE，經(jīng)理化特性檢測、TCID50測定、RT-PCR鑒定及序列比對，最終確定該分離毒株為流行性腹瀉病毒(PEDV)，將其命名為PEDV HZ株。以分離株RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出大小為681 bp和1 326 bp的M基因和N基因，并與其他國內(nèi)外分離株的相應(yīng)基因進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，PEDV HZ株與其他國內(nèi)外分離株的M基因和N基因核苷酸序列的同源性分別為98.1%～100%和93.9%～100%，氨基酸序列的同源性分別為96.9%～99.6%和93.0%～100%，遺傳進(jìn)化樹分析顯示，PEDV HZ株與中國株CHGD-01處于同一個(gè)進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近。

豬流行性腹瀉病毒；分離鑒定；M基因；N基因；序列分析

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，是豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)的病原[1]。PED是一種高度接觸性腸道傳染病，主要臨床特征為厭食、體溫升高、水樣糞便、嘔吐及脫水[1]。冬春季節(jié)是PED的高發(fā)季，各年齡段的豬均可感染，該病對1周齡以內(nèi)哺乳仔豬的危害性最大，病死率可達(dá)100%；母豬和斷奶豬的病死率相對較低，但部分豬恢復(fù)生長后發(fā)育不良，料肉比大幅度增加，給養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-5]，因此PED是目前養(yǎng)豬生產(chǎn)中重點(diǎn)防控的傳染病之一。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，近幾年P(guān)ED在中國各地廣泛流行，成為養(yǎng)豬生產(chǎn)的防控難題[6-8]。本試驗(yàn)從陜西省某豬場送檢的腹瀉仔豬小腸內(nèi)容物等樣品中分離到1株病毒，并對該毒株的M基因和N基因進(jìn)行序列對比，經(jīng)過一系列鑒定確定分離株為PEDV，將其命名為PEDV HZ株，為PEDV進(jìn)一步的研究及PED的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和細(xì)胞株 病料為陜西省某養(yǎng)豬場送檢的病死仔豬出血嚴(yán)重的小腸及其內(nèi)容物，仔豬死前主要表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉、糞便惡臭并且脫水嚴(yán)重，病料保存于-80℃?zhèn)溆?。Vero細(xì)胞由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 新生牛血清、胰酶及DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，UIBCO公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、2×TaqMasterMix、Trizol Reagent，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；病毒RNA提取試劑盒(HiScript4Q RT SuperMix for qPCR)，諾唯贊生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 取凍存的腹瀉仔豬小腸病料，室溫解凍進(jìn)行磨碎，用含1 000 IU/mL青霉素和1 000 μg/mL鏈霉素的PBS制成5倍懸液，反復(fù)凍融3次后，8 000 r/min 離心10 min，取上清，用孔徑為0.22 μm的濾器過濾后置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒分離培養(yǎng) 無菌培養(yǎng)Vero細(xì)胞傳至10 cm培養(yǎng)皿中，使其長滿單層且狀態(tài)良好時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，用PBS洗1次，將1 mL處理好的病料和5 μL的胰酶(終濃度為10 μg/mL)接種于Vero細(xì)胞，置37℃吸附1 h后，吸出接種液，加入維持液(含終濃度為10 μg/mL胰酶)培養(yǎng)3 d，反復(fù)凍融3次，取凍融物繼續(xù)接種，定期觀察CPE，盲傳至出現(xiàn)穩(wěn)定CPE,待CPE達(dá)到70%～80%時(shí)收毒置-80℃保存。

1.2.3 病毒TCID50測定 制備96孔板單層貼壁細(xì)胞；用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基將1.2.2收獲的病毒液按照10-1～10-10倍系列稀釋；無菌操作，取出長滿單層細(xì)胞的96孔板，棄除培養(yǎng)基，每孔用150 μL的PBS洗2次。按照稀釋度的高低將病毒液從左到右依次加入96孔板中(每列一個(gè)稀釋度)，11列和12列加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，100 μL/孔，培養(yǎng)箱中孵育1 h后棄除病毒液。加入100 μL/孔的細(xì)胞維持液(含胰酶)，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d，每天觀察記錄細(xì)胞孔病變情況，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 病毒核酸類型鑒定 根據(jù)藥物抑制法[9]，即5溴脫氧尿嘧啶核苷(BUDR)法對病毒核酸類型進(jìn)行鑒定。在細(xì)胞維持液中加入BUDR(50 mg/L)，其他步驟同1.2.3，同時(shí)設(shè)立對照組，測定2組病毒TCID50，觀察BUDR存在是否影響病毒的增殖，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 病毒氯仿敏感性試驗(yàn) 用氯仿處理病毒，即在病毒液中加入氯仿(終濃度4.8%)，4℃振蕩混勻10 min，3 000 r/min離心5 min后，收集上清，按常規(guī)方法接種于長滿單層Vero細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立未經(jīng)氯仿處理的病毒液作為陰性對照組，定期觀察細(xì)胞病變情況。

1.2.6 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PEDV的M基因和N基因的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增針對M基因和N基因的特異性引物。M基因的上游引物F1：5′-ATGTCTAACGGTTCTATT-3′；下游引物R1：5′-CGACTAAATGAAGCAC-3′,目的片段大小為681 bp。N基因的上游引物F2：5′-ATGGCTTCTGTCAGCTTTCA-3′；下游引物R2:5′-ATTTCCTGTATCGAAGAT-3′,目的片段大小為1 326 bp。將各引物稀釋至20 μmol/L，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 病毒核酸提取和目的基因擴(kuò)增 取200 μL盲傳的病毒細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)Trizol Reagent說明書提取RNA。以提取的病毒RNA為模板，參照HiScript○RQ RT SuperMix for qPCR試劑盒操作說明，將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT反應(yīng)體系及參數(shù)：7 μL的RNA模板、1 μL的隨機(jī)引物，56℃水浴5 min，冰浴2 min，加10 μL 2×RT Mix、2 μL HiScript○REnzymebMix，25℃反應(yīng)5 min，50℃ 45 min,85℃ 5 min。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增M基因和N基因。PCR反應(yīng)體系：10 μL 2×TaqPCR Mix，0.5 μL上、下游引物，3 μL cDNA，6 μL H2O。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 50 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將經(jīng)以上步驟擴(kuò)增獲得的M基因和N基因的PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行序列測定。

1.2.8 序列分析 登錄NCBI GenBank，下載國內(nèi)外10株P(guān)EDV毒株的M基因和N基因序列，用DNA Star軟件對M基因和N基因的測序結(jié)果與該10株P(guān)EDV M基因和N基因序列進(jìn)行同源性比對分析，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。10株P(guān)EDV參考毒株分別為中國株P(guān)EDV-LY(KM609210.1)、YN1-PEDV(KT021227.1)、CH-GDZQ(KM242131.1)、CHGD-01(JX261936.1)及CV777(AF353511.1)；日本株AOM-3-JPN(LC063833.1)和FKO-1-JPN( LC063811.1)；美國株USA-Minnesota236(KR265794.1)和PC177(KR078300.1)；韓國株KUIDL-PED(KJ588063.1)。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果

將處理的病毒液接種于Vero細(xì)胞，盲傳至第3代未見明顯的CPE，盲傳第4代以后，細(xì)胞有明顯的皺縮，聚堆以及變圓等現(xiàn)象，盲傳至第8代以后，細(xì)胞特征性病變明顯，細(xì)胞呈現(xiàn)變圓、聚集、皺縮、出現(xiàn)拉網(wǎng)狀并最終脫落等病理現(xiàn)象(圖1)。

A.正常Vero細(xì)胞(40×)；B.接第8代毒后的Vero細(xì)胞(40×)

A.Normal Vero cells(40×); B.Vero cells inoculated with eighth generations of virus(40×)

圖1 正常Vero細(xì)胞和接毒后的Vero細(xì)胞

Fig.1 Normal Vero cells and Vero cells after virus inoculation

2.2 分離毒TCID50測定

將連續(xù)10倍稀釋的病毒液接種于Vero細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)7 d后，根據(jù)細(xì)胞孔出現(xiàn)病變的數(shù)目(表1)，按照Reed-Muench法計(jì)算出該病毒液的TCID50=104.7/0.1 mL。

2.3 病毒核酸類型鑒定結(jié)果

按照BUDR法對該分離株的核酸類型進(jìn)行鑒定，3次試驗(yàn)的平均結(jié)果顯示，對照組的TCID50=104.7/0.1 mL，試驗(yàn)組的TCID50=104.42/0.1 mL。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)組和對照組的差異不顯著(P>0.05)，即培養(yǎng)液中加入BUDR后，對病毒的增殖無影響，說明該分離株為RNA病毒。

表1 細(xì)胞被不同濃度PEDV感染后CPE統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 病毒氯仿敏感性

試驗(yàn)結(jié)果顯示，用氯仿處理后的病毒液接種Vero細(xì)胞后，細(xì)胞病變(CPE)不明顯，而未經(jīng)氯仿處理過的病毒液，接種Vero細(xì)胞后第3天細(xì)胞病變達(dá)到80%以上，說明該分離株對氯仿高度敏感，因此該病毒有囊膜。

2.5 分離株的RT-PCR鑒定結(jié)果

以提取的分離株總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR，分別擴(kuò)增出到M基因和N基因，片段大小與預(yù)期結(jié)果相符，分別為681 bp和1 326 bp(圖2)。說明該分離株為PEDV，將其命名為PEDV HZ株。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 5 000；1.M 基因；2.N 基因；3.陰性對照

M.DNA Marker DL 5 000; 1.M gene; 2.N gene; 3.Negative control

圖2 分離株M基因和N基因的擴(kuò)增

Fig.2 The amplification of M and N genes of isolate

2.6 分離株M基因的序列分析

通過軟件對該分離毒株M基因測序結(jié)果進(jìn)行分析，顯示M基因片段大小為681 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。序列分析結(jié)果顯示，PEDV HZ株與國內(nèi)外其他參考毒株間有較高的同源性，核苷酸的同源性為98.1%～100%，氨基酸的同源性為96.9%～99.6%。M基因的系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果表明(圖3)，PEDV HZ株與中國株CHGD-01共處于一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近。

2.7 分離株N基因的序列分析

通過軟件對該分離毒株N基因測序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，N基因片段大小為1 326 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。序列分析結(jié)果顯示，PEDV HZ株與國內(nèi)外其他參考毒株有較高的同源性，核苷酸的同源性為93.9%～100%，氨基酸的同源性為93.0%～100%。N基因的系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果表明(圖4)，PEDV HZ株與中國株CHGD-01關(guān)系較近，共處于一個(gè)分支。

圖3 PEDV HZ株和PEDV參考株M基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹

圖4 PEDV HZ株和PEDV參考株N基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹

3 討論

PEDV為單鏈正股RAN病毒，基因組的復(fù)制和和病毒粒子的成熟均在胞漿中進(jìn)行，并且該病毒在腸系膜淋巴結(jié)和腸絨毛上皮細(xì)胞中的含量高[10-11]。PEDV的人工培養(yǎng)與其他冠狀病毒比較相對較困難，雖能感染PK-15和ST等豬源細(xì)胞，但PEDV對其適性差，細(xì)胞病變不明顯，培養(yǎng)困難[12-13]。目前，PEDV適應(yīng)性最強(qiáng)的細(xì)胞為Vero細(xì)胞，且一定濃度的胰酶可以增強(qiáng)其對Vero細(xì)胞的感染性[14]。因此，本研究將處理過的病死仔豬的小腸及其內(nèi)容物接種于Vero細(xì)胞，并加入含胰酶(終濃度為10 μg/mL)的細(xì)胞培養(yǎng)液，對PEDV進(jìn)行分離鑒定，盲傳第1代至第3代未見明顯的CPE，盲傳第4代以后，細(xì)胞有明顯的皺縮、聚堆以及變圓等現(xiàn)象，盲傳至第8代以后，細(xì)胞特征性病變明顯，細(xì)胞呈現(xiàn)變圓、聚集、皺縮及最終脫落等病理現(xiàn)象。對分離株進(jìn)行氯仿敏感性和核型鑒定，結(jié)果顯示，該分離株對氯仿敏感性強(qiáng)但對BUDR不敏感，對分離株進(jìn)行RT-PCR鑒定，結(jié)果成功擴(kuò)增出PEDV M基因和N基因序列，因此最終確定該分離株為PEDV，將其命名為PEDV HZ株。

PEDV的M基因和N基因是其主要的結(jié)構(gòu)蛋白基因，M基因在病毒裝配以及出芽的過程中發(fā)揮重要作用，N基因在病毒核酸的轉(zhuǎn)錄復(fù)制中發(fā)揮一定的作用，并且N蛋白可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高效的免疫應(yīng)答[13-14]。對分離株M基因和N基因與國內(nèi)外其他PEDV分離株進(jìn)行比較，M基因核苷酸的同源性為98.1%～100%，氨基酸的同源性為96.9%～99.6%，N基因核苷酸的同源性為93.9%～100%，氨基酸的同源性為93.0%～100%，分析結(jié)果表明，PEDV的M基因和N基因有較高的保守性。進(jìn)化樹分析表明，PEDV HZ株與中國株CHGD-01處于同一個(gè)進(jìn)化分支，親緣關(guān)系近。測定PEDV HZ株的TCID50為104.7/0.1 mL，說明該病毒的滴度高，有較高的體外培養(yǎng)穩(wěn)定性。本試驗(yàn)通過病毒的分離培養(yǎng)、理化特性鑒定、RT-PCR鑒定及序列分析從陜西省某養(yǎng)豬場送檢的病死仔豬的小腸病料中分離到一株P(guān)EDV，將其命名為PEDV HZ株，為后續(xù)PEDV的分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2013:194-196.

[2] 卓秀萍,朱 玲,喬小改,等.人工感染豬流行性腹瀉病毒的哺乳仔豬的病理學(xué)觀察[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2015,45(2):202-207.[3] 施 標(biāo),董世娟,朱于敏,等.中國豬流行性腹瀉病毒分子流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(20):4362-4369.

[4] ?？〕?黃復(fù)深,胡佩佩.豬流行性腹瀉研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,35(10):107-110.

[5] 高君愷,劉浩飛,楊倩.豬流行性腹瀉病毒的研究進(jìn)展[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,37(1):1-5.

[6] 陶 潔,熊年年,張春玲,等.PEDV流行株的分離鑒定及其遺傳進(jìn)化分析[J].病毒學(xué)報(bào),2016,32(5):603-609.

[7] 莊金秋,王金良,梅建國,等.豬流行性腹瀉病毒SDbz株的分離與鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,34(2):122-126.

[8] Pan Y,Tian X,Wei L,et al.Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China.[J].Virol J,2012,9(1):195.

[9] 付夢瑾,朱 玲,吳云飛,等. 豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及增殖規(guī)律[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué),2013,43(11):1133-1139.

[10] Li Z L,Zhu L,Ma J Y,et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) field strains in south China[J].Virus Genes,2012,45(1):181-185.

[11] 毛雅元,張桂紅,葛俊偉,等.豬流行性腹瀉病毒地方株LJB/03分離及培養(yǎng)特性[J].病毒學(xué)報(bào),2010,26(6):483-489.

[12] Oka T,Saif L J,Marthaler D,et al.Cell culture isolation and sequence analysis of genetically diverse US porcine epidemic diarrhea virus strains including a novel strain with a large deletion in the spike gene[J].Vet Microbiol,2014,173(3-4):258-269.

[13] Hofmann M, Wyler R. Quantitation, biological and physicochemical properties of cell culture-adapted porcine epidemic diarrhea coronavirus (PEDV)[J]. Vet Microbiol, 1989, 20(2):131-142.

[14] Song D,Huang D,Qi P,et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea viruses associated with outbreaks of severe diarrhea in piglets in Jiangxi,China 2013[J].PLoS One,2015,10(3):e0120310.

Isolation and Identification of Porcine Epidemic Diarrhea Virus HZ Strain

PANG Wen-jing,FU Ming-zhe,XU Xin-gang,GUO Kang-kang,ZHANG Qi

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

A virus strain was isolated from intestinal contents of dead piglets from a pig farm in Shaanxi province.The inoculated Vero cells showed the stable cytopathogenic effect after the eighth generation.The PEDV virus strain was finally confirmed by physicochemical tests,TCID50assay,RT-PCR identification and sequence alignment,and it was named as PEDV HZ strain.The total RNA of isolated strain was as template,the N and M genes of 681 bp and 1 326 bp were amplified by RT-PCR.The nucleotide sequences of M and N genes of PEDV HZ strain shared 98.1%-100% and 93.9%-100% identity with other domestic and foreign virus strains.The amino acids sequences of M and N genes of PEDV HZ strain shared 96.9%-99.6% and 93%-100% identity with other domestic and foreign virus strains.The phylogenetic trees showed that PEDV HZ strain had a closer relationship with the CHGD-01 strain.

Porcine epidemic diarrhea virus; isolation and identification; M gene; N gene; sequence analysis

2016-10-29

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-095)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(Z109021427)

龐文靜(1991-)，女，江蘇連云港人，碩士研究生，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2017)07-0027-04