歐陽資章，朱少華，鄔淑紅，劉曉萍，?；荻Y，麥露絲，肖誠胤

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院，廣東 清遠 511515； 2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.廣東省清遠市婦幼保健院，廣東 清遠 511500）

·實驗研究·

山楂酸對順鉑腎毒性的影響研究*

歐陽資章1，朱少華2，鄔淑紅3，劉曉萍1，?；荻Y1，麥露絲1，肖誠胤1

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院，廣東 清遠 511515； 2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.廣東省清遠市婦幼保健院，廣東 清遠 511500）

目的 探討山楂酸對順鉑誘導(dǎo)腎損傷的影響。方法 選用人腎小管上皮HK－2細胞，試驗共分4組，即對照組、順鉑組、山楂酸保護組(山楂酸＋順鉑)、維生素E保護組(維生素E＋順鉑)。應(yīng)用MTT法檢測各組細胞活性，檢測乳酸脫氫酶（LDH）濃度以判斷腎細胞損傷情況，Hochest33342／PI染色法測定細胞凋亡情況。結(jié)果 加入順鉑24 h后，HK－2細胞存活率明顯下降，LDH釋放增加，并觀察到細胞凋亡；而預(yù)先給予山楂酸以及維生素E，細胞存活率明顯增加，LDH釋放減少，細胞凋亡減少。結(jié)論 在HK－2細胞試驗中，山楂酸對順鉑所致細胞毒性有防護作用。

山楂酸；順鉑；腎損傷；乳酸脫氫酶

順鉑為廣泛應(yīng)用的鉑類抗腫瘤藥物，在許多腫瘤的治療中療效顯著。作為細胞毒性藥物，腎毒性為其主要不良反應(yīng)，不僅影響順鉑的用藥劑量及化學(xué)治療（簡稱化療）進程，且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，在很大程度上限制了順鉑的臨床應(yīng)用。臨床雖可采取水化方法或使用滲透性利尿藥以減少腎毒性，但順鉑所致腎毒性的發(fā)生率仍高達30%以上[1]。山楂酸為五環(huán)三萜酸，存在于山楂、紅棗等多種植物中，近年來研究發(fā)現(xiàn)，其具有多種藥理活性，如抗癌[2]、抗氧化[3－4]、抗艾滋病[5]、抗菌[6]、抗2型糖尿病[7]、舒張動脈血管[8]等作用。在前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)山楂酸具有抗氧化作用，且對順鉑所致大鼠腎毒性具有防護作用[8]，為此，筆者以人腎小管上皮細胞為研究對象，研究山楂酸是否對順鉑所致腎小管上皮細胞毒性有防護作用，旨在為山楂酸的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥、細胞及儀器

試藥及細胞：山楂酸（長沙雅瑩生物科技有限公司，批號為20130712）；順鉑（南京建成生物工程研究所，批號為20130327）；維生素E（中國食品藥品檢定研究院，批號為20130209）。人近段腎小管上皮HK－2細胞（中山大學(xué)動物實驗中心細胞庫提供，2012年引進）；MTT試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號為20130518）；LDH試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號為20130623）；DMEM干粉培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司，批號為1272041）。

儀器：TGLL－18G型臺式低溫高速冷凍離心機（太倉市醫(yī)療器械廠）；SW－CJ－2FD型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；755S型紫外分光光度計（上海第三分析儀器廠）；BS223S型電子天平（北京賽多利斯儀器系列有限公司）；WJ－3－80型CO2培養(yǎng)箱（上海市躍進醫(yī)療器械廠）；318C＋型多功能酶標(biāo)儀（上海沛歐分析儀器有限公司）；TE2000－U型熒光顯微鏡（日本株式會社尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 MTT試驗

取對數(shù)生長期細胞，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，調(diào)細胞密度至2.5×104個／m L，以每孔5×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為200μL，將培養(yǎng)板放入CO2孵箱，在37℃及5%CO2條件下，培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入180μL培養(yǎng)基，將配制好的順鉑貯備液加入無血清培養(yǎng)基中，無菌過濾，加入相應(yīng)板相應(yīng)孔中，終液200μL，孵育24 h。試驗分為對照組、順鉑組、山楂酸保護組、維生素E保護組。對照組不加任何藥物，順鉑組藥物終質(zhì)量濃度為100mg／L，山楂酸保護組、維生素E保護組需預(yù)先分別給予無菌過濾的山楂酸（終質(zhì)量濃度為40mg／L）及維生素E（終質(zhì)量濃度為100 mg／L）0.5 h后再給予順鉑（終質(zhì)量濃度為100mg／L），24 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔各加180μL無血清高糖DMEM培養(yǎng)液和MTT溶液（5mg／L）20μL，37℃繼續(xù)孵育4 h。孵育結(jié)束后小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕洗滌1次，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩10 min，使甲 充分溶解，選擇570 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度，記錄結(jié)果，并計算其生存率。

1.2.2 乳酸脫氫酶（LDH）活性測定

細胞上清液中LDH含量可反映細胞發(fā)生晚期凋亡及壞死的程度。試驗分組及藥物終質(zhì)量濃度同MTT試驗。取對數(shù)生長期的HK－2細胞，以2×105個／孔的密度接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后更換無血清培養(yǎng)基使之同步化。12 h后棄去無血清培養(yǎng)基，換成含血清1%的培養(yǎng)基，加入已用無血清的稀釋并過濾的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集細胞上清，液測定細胞LDH活性。或在加入順鉑前，預(yù)先給予山楂酸或者維生素E，于相應(yīng)時間點收集細胞培養(yǎng)上清液，測定LDH活性。

1.2.3 Hoechst33342／PI染色法測定細胞凋亡和壞死

試驗分組及藥物終質(zhì)量濃度同MTT試驗。取對數(shù)生長期的細胞消化，接種于6孔板，每孔接種細胞數(shù)量為8×105個，體積為2 mL，24 h后棄去培養(yǎng)基，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。12 h后棄去無血清培養(yǎng)基，換成無血清的培養(yǎng)基，加入已用無血清的稀釋并過濾的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細胞2次，加入Hoechst33342以及PI，37℃染色5～10 min。染色后棄去染色液，用PBS輕輕洗滌細胞2次，在熒光顯微鏡下觀察，照相保留結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。除形態(tài)學(xué)結(jié)果外，其他數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行 t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山楂酸對順鉑誘導(dǎo)HK－2細胞存活率的影響

結(jié)果見表1。對照組細胞活力未改變，順鉑組細胞存活率與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；而預(yù)先給予山楂酸或維生素E，均能增加細胞活力，與順鉑組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 山楂酸對順鉑誘導(dǎo)HK－2細胞存活率的影響

2.2 LDH漏出量檢測結(jié)果

結(jié)果見表2。順鉑刺激細胞后，上清液中LDH含量明顯增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；預(yù)先給予山楂酸或維生素E能減少上清液中LDH含量，與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組LDH漏出情況

2.3 細胞凋亡和壞死結(jié)果

結(jié)果見圖1。對照組未見凋亡細胞、壞死細胞或晚期凋亡小體，順鉑組可見凋亡小體（亮藍色，即圖中亮色箭頭所指處）及晚期凋亡小體（紅色，核斷裂，即圖中暗色箭頭所指處）。預(yù)先給予山楂酸或維生素E，凋亡細胞及壞死細胞均減少。

3 討論

順鉑是目前臨床常用的重要的金屬鉑類化療藥物，其療效肯定，作用強度隨劑量增加而增大。順鉑在體內(nèi)主要經(jīng)腎臟排泄，金屬鉑離子可蓄積在腎臟，故其腎毒性最明顯。順鉑對腎臟的不同部位均有毒性，可引起腎小球、腎小管功能及形態(tài)學(xué)改變。其主要損傷腎小管，特別是近曲小管和集合管，使上皮細胞水腫變性，基底增厚，腎間質(zhì)輕度纖維化，可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡、壞死[7，9－10]。

A.對照組 B.順鉑組 C.山楂酸保護組D.維生素E保護組圖1 Hoechast33342／PI染色法測定細胞凋亡和壞死

目前，臨床主要采取水化方法減輕順鉑的細胞毒性[11]。一直以來，盡管缺乏明確的證據(jù)，許多醫(yī)療機構(gòu)仍將水化＋甘露醇作為常規(guī)預(yù)防措施，以加快順鉑從體內(nèi)消除，減少毒副反應(yīng)。但大量水化對心、腎功能不全，胸、腹腔積液及糖尿病患者不適用，而解毒劑等僅適用于雙路療法的患者，且有可能降低療效。近年來，一些天然活性物質(zhì)因獨特的作用機制顯示了對腫瘤化療的增效作用，且對機體無毒[12－14]，但在動物實驗或?qū)嶋H應(yīng)用中并未獲得良好的療效。

Montilla等[14]發(fā)現(xiàn)，山楂酸能抑制由氧自由基引起的肝細胞膜中的脂質(zhì)過氧化，可能抵抗生物體內(nèi)的氧化應(yīng)激作用，避免細胞受到損傷。順鉑的腎毒性可能與氧化應(yīng)激及其金屬鉑離子在腎臟蓄積有關(guān)。山楂酸為新型糖原磷酸化酶抑制劑，能抑制糖酵解，進而產(chǎn)生抗氧化作用。

前期研究結(jié)果顯示，山楂酸對順鉑的腎毒性確實具有防護作用[8]。因此，本研究中采用人近段腎小管上皮細胞為模型細胞，研究山楂酸是否對順鉑所致人腎小管上皮細胞毒性同樣具有防護作用[15]。本研究中選擇HK－2細胞作為體外觀察順鉑腎毒性的細胞模型，MTT試驗結(jié)果表明，順鉑能降低細胞活力，而山楂酸則能增加細胞活力。LDH是存在于細胞質(zhì)中的蛋白酶，當(dāng)細胞膜完整時，其并不能溢出至細胞外。一旦細胞膜被破壞，細胞發(fā)生壞死時，LDH則釋放至細胞外。不過，體外培養(yǎng)細胞在晚期凋亡時，如凋亡小體得不到及時清除，凋亡小體的膜通透性會增加，LDH也會釋放至培養(yǎng)液中。本研究中給予順鉑后，LDH釋放明顯增加，而預(yù)先給予山楂酸則能減少順鉑所致的LDH釋放，進一步印證了山楂酸對腎細胞的保護作用。Hoechst33342／PI染色試驗表明，順鉑能誘導(dǎo)細胞凋亡及壞死，而山楂酸能減少腎細胞凋亡及壞死數(shù)量。

Ramesh等[11]的研究結(jié)果顯示，氧化性損傷可能是順鉑引起腎功能損傷的主要原因，而氧化應(yīng)激反應(yīng)及在氧化過程中產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物，可直接損傷細胞核酸、蛋白質(zhì)、黏多糖和脂類物質(zhì)，并通過多種途徑激活細胞內(nèi)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起組織細胞凋亡，從而導(dǎo)致有功能的腎小管細胞、腎小球和腎實質(zhì)細胞損害和壞死，導(dǎo)致腎功能短時間內(nèi)急劇衰退，表現(xiàn)為急性腎功能損害。山楂酸具有良好的抗氧化作用，能抑制由羥基自由基誘導(dǎo)的肝細胞膜和血漿中脂質(zhì)過氧化，且對脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的一氧化氮(NO)有強烈抑制作用?？梢姡介峥赡苤饕ㄟ^其良好的抗氧化作用起到改善順鉑對腎臟細胞的損害作用。

綜上所述，山楂酸對順鉑所致HK－2細胞毒性有防護作用，有望成為順鉑所致腎毒性的治療藥物。但本研究并未深入研究其確切機制，尚待進一步探討。

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Effect of M aslinic Acid on Cisp latin－Induced Nephrotoxicity

Ouyang Zizhang1，Zhu Shaohua2，Wu Shuhong3，Liu Xiaoping1，Chang Huili1，Mai Lusi1，Xiao Chengyin1
（1.The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Qingyuan，Guangdong，China 511515； 2.School of Pharmacy，Zhongshan University，Guangzhou，Guangdong，China 510006； 3.Maternal and Child Health Care Hospital of Qingyuan City，Qingyuan，Guangdong，China 511500）

Objective To investigate the effect of maslinic acid on Cisplatin－induced toxicity in kidney injury.M ethods Renal tubular epithelial（HK－2）cells were selected.The experiment was divided into four groups：control group，Cisplatin group，maslinic acid protection group（maslinic acid＋Cisplatin），Vitamin E protection group（Vitamin E ＋ Cisplatin）.MTT was used to assess the viability of cell.Lactate dehydrogenase（LDH）was assessed to evaluate the kidney injury.Hochest 33342／PI was applied to determine the apoptosisof cell.Results After treatment of Cisplatin to HK－2 cell for 24 h，the viability of cell was significantly decreased，the release of LDH was increased，and the apoptosis of HK－2 cell was observed.However，when pretreatment of either maslinic acid or Vitamin E，the viability of cell was increased obviously，the release of LDH was decreased and the apoptosis of cell was decreased.Conclusion In HK－2 cells experiments，maslinic acid has protective effects on Cisplatin－induced toxicity.

maslinic acid；Cisplatin；kidney injury；lactate dehydrogenase

R285.5；R282.71；R979.1

：A

：1006－4931(2017)12－0007－04

2017－03－10；

2017－03－28)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.12.002

廣東省清遠市科技計劃項目[2012B011204020]。

歐陽資章（1973－），漢族，博士研究生，副主任藥師，研究方向為藥物毒理學(xué)，（電子信箱）oyzz8100＠126.com。