黃鋒，孫娟，楊智華，賈巖龍，邵煥霞，劉會(huì)茹，詹合琴

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

?

人參皂苷Rg1灌胃對(duì)大鼠特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的治療作用及其機(jī)制探討

黃鋒1，孫娟1，楊智華2，賈巖龍1，邵煥霞1，劉會(huì)茹1，詹合琴1

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

目的 觀察人參皂苷Rg1灌胃對(duì)大鼠特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)的治療作用，并探討其機(jī)制。方法 雄性SD大鼠138只，分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組和實(shí)驗(yàn)3組。假手術(shù)組不做IPF模型；模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組和實(shí)驗(yàn)3組用博來(lái)霉素氣管內(nèi)注射誘導(dǎo)IPF模型，于造模當(dāng)天，陽(yáng)性對(duì)照對(duì)照組給予5 mg/kg的醋酸潑尼松灌胃，實(shí)驗(yàn)1、2、3組18、36、72 mg/kg的人參皂苷Rg1灌胃，模型組給予等體積生理鹽水灌胃，給藥1次/d。于給藥第7、28天分別處死各組小鼠，采用肺濕重法測(cè)算肺系數(shù)，采用ELISA法檢測(cè)肺組織中的α-肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，采用qPCR法檢測(cè)肺組織中的血小板源性生長(zhǎng)因子-A(PDGF-A) mRNA。結(jié)果 給藥第7、28天時(shí)，模型組肺系數(shù)均高于其余各組(P均<0.01)，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組的肺系數(shù)均高于假手術(shù)組(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)2、3組肺系數(shù)低于陽(yáng)性對(duì)照組(P均<0.05)。給藥第28天時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組肺系數(shù)低于模型組，但高于假手術(shù)組(P均<0.05)。模型組肺組織α-SMA水平高于假手術(shù)組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)1、2、3組及陽(yáng)性對(duì)照組α-SMA水平低于模型組(P均<0.05)。給藥第7、28天時(shí)，模型組肺組織中PDGF-A mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其余各組(P均<0.05)。給藥第28天時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組肺組織中PDGF-A mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組，實(shí)驗(yàn)1、2、3組肺組織中PDGF-A mRNA相對(duì)表達(dá)量低于陽(yáng)性對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論 人參皂苷Rg1灌胃可降低IPF大鼠的肺系數(shù)及肺組織中α-SMA水平；人參皂苷Rg1有一定的抗肺纖維化作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PDGF-A表達(dá)有關(guān)。

肺纖維化；人參皂苷Rg1；肺系數(shù)；α-肌動(dòng)蛋白；血小板源性生長(zhǎng)因子-A

近年來(lái)，特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，IPF可導(dǎo)致呼吸衰竭和死亡[1，2]，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。IPF主要特點(diǎn)是異常的成纖維細(xì)胞數(shù)量增加和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過(guò)度積累[3]。IPF單用抗生素或激素類(lèi)藥物進(jìn)行抗炎治療效果差，因此，目前對(duì)于IPF的處理措施已由單純的抗炎治療轉(zhuǎn)向抗纖維化治療[4]。IPF一方面可導(dǎo)致肺功能?chē)?yán)重受損，另一方面可使肺系數(shù)、肺纖維化標(biāo)志物α-肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)含量的血小板源性生長(zhǎng)因子-A(PDGF-A)表達(dá)異常增加[5]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，三七總皂苷具有顯著的抗肺纖維化作用[6]。人參皂苷Rg1是三七總皂苷的主要活性成分[7]，但人參皂苷Rg1對(duì)IPF的治療作用及其機(jī)制尚不明確。2013年4月～2015年4月，我們采用博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型，觀察人參皂苷Rg1對(duì)肺纖維化大鼠肺系數(shù)及肺組織中α-SMA水平、PDGF-A mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 清潔級(jí)雄性SD大鼠138只，體質(zhì)量210～240 g，購(gòu)于鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物合格證號(hào)0005496)。博萊霉素(日本化藥株式會(huì)社)，人參皂苷Rg1(四川成都瑞芬思生物科技有限公司)，PDGF-A和內(nèi)參GAPDH(鄭州樂(lè)睿生物科技有限公司)。α-SMA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(南京Vazyme科技公司)。Nanodrop-2000紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛世爾公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 IPF模型制作及人參皂苷Rg1用法 選取120只大鼠制作IPF模型，剩余18只為假手術(shù)組。IPF模型制備方法如下：向大鼠腹腔內(nèi)注射10%的水合氯醛300 mg/kg麻醉，仰臥位固定；切開(kāi)頸部，迅速分離氣管，快速注入博來(lái)霉素5 mg/kg，將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)數(shù)次，使藥物快速、均勻地分散到肺組織；縫合手術(shù)創(chuàng)口，回籠飼養(yǎng)觀察；參考文獻(xiàn)[8]方法以肺纖維化評(píng)分和肺組織中α-SMA水平判定模型制作是否成功。假手術(shù)組除在氣管內(nèi)注入生理鹽水外，其余操作與制作模型的動(dòng)物相同。將模型制作成功的動(dòng)物120只隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組和實(shí)驗(yàn)3組，每組各24只。于造模當(dāng)天開(kāi)始灌胃給藥，1次/d。陽(yáng)性對(duì)照組給予醋酸潑尼松5 mg/kg；實(shí)驗(yàn)1、2、3組分別給予18、36、72 mg/kg的人參皂苷Rg1；假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水5 mL/kg。給藥第7、28天時(shí)處死假手術(shù)組中的9只大鼠，其余各組處死10只，用于肺系數(shù)、α-SMA和PDGF-A mRNA測(cè)定。

1.3 肺系數(shù)測(cè)算 動(dòng)物稱重后處死，取肺臟反復(fù)沖洗至組織發(fā)白，稱取肺濕重，用公式計(jì)算肺系數(shù)：肺系數(shù)=肺濕重(mg)/體質(zhì)量(g)×100。

1.4 肺組織中α-SMA檢測(cè) 采用ELISA法。給藥第28天時(shí)處死各組大鼠，取右下葉肺組織0.2 g，加入1.8 mL的冰鹽水，離心取上清液，4 ℃保存。加入考馬斯亮藍(lán)對(duì)各樣品進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度和吸光度值(OD值)算出α-SMA的回歸方程。用MulTISKAN酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每個(gè)樣本α-SMA的有色試樣OD值，然后將樣品OD值代入方程計(jì)算樣品濃度，再乘稀釋倍數(shù)，即可得出每個(gè)樣品α-SMA水平。

1.5 肺組織中PDGF-A mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。取大鼠左肺組織100 mg在液氮中磨碎，用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取cDNA 1 μL用AceQTMqPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺系數(shù)比較 給藥第7、28天模型組肺系數(shù)均高于其余各組(P均<0.01)，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組的肺系數(shù)均高于假手術(shù)組(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)2、3組肺系數(shù)低于陽(yáng)性對(duì)照組(P均<0.05)。給藥第28天陽(yáng)性對(duì)照組肺系數(shù)低于模型組，但高于假手術(shù)組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺系數(shù)比較

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，△P<0.05。

2.2 各組大鼠肺組織α-SMA水平比較 給藥第28天時(shí)，假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組肺組織中α-SMA水平分別為(0.98±0.19)、(1.25±0.13)、(1.00±0.16)、(1.04±0.12)、(1.01±0.13)、(0.95±0.20)pg/mL。模型肺組織α-SMA水平高于假手術(shù)組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)1、2、3組及陽(yáng)性對(duì)照組α-SMA水平低于模型組(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)1、2、3組肺組織中α-SMA水平與陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3 各組大鼠肺組織中PDGF-A mRNA表達(dá)比較 給藥第7、28天時(shí)，模型組肺組織中PDGF-A mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其余各組(P均<0.05)。給藥第28天時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組肺組織中PDGF-A mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組，實(shí)驗(yàn)1、2、3組肺組織中PDGF-A mRNA相對(duì)表達(dá)量低于陽(yáng)性對(duì)照組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肺組織中PDGF-A mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，△P<0.05。

3 討論

博來(lái)霉素氣管內(nèi)給藥誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型被廣泛用于IPF的發(fā)病機(jī)制研究和抗IPF藥物的篩選，具有操作簡(jiǎn)單、方法可靠和實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，為目前公認(rèn)的經(jīng)典造模方法[9]。在本實(shí)驗(yàn)中我們制作該模型并分別于給藥第7、28天進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，給藥第7、28天時(shí)，模型組肺系數(shù)均高于其余各組，造模7天肺系數(shù)增高往往反映肺泡炎的發(fā)生，而造模28天的肺系數(shù)增高與動(dòng)物肺組織中的α-SMA水平增高往往預(yù)示著肺纖維化的發(fā)生，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[10，11]。

肺系數(shù)和α-SMA水平是反映肺纖維化的重要指標(biāo)，兩者與肺纖維化的程度有著密切的聯(lián)系。許多研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化時(shí)動(dòng)物的肺系數(shù)與α-SMA水平均增高[12]。α-SMA為肺纖維化的標(biāo)志物之一，其表達(dá)增高預(yù)示著肌成纖維母細(xì)胞形成，從而發(fā)生Ⅰ型膠原沉積，導(dǎo)致肺纖維化[13]。本研究結(jié)果顯示，給藥第7、28天時(shí)，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組的肺系數(shù)均高于假手術(shù)組，實(shí)驗(yàn)2、3組肺系數(shù)低于陽(yáng)性對(duì)照組；給藥第28天時(shí)，模型組肺組織α-SMA水平高于假手術(shù)組，實(shí)驗(yàn)1、2、3組及陽(yáng)性對(duì)照組α-SMA水平低于模型組。上述結(jié)果提示人參皂苷Rg1可減輕肺纖維化程度，高劑量組效果更為明顯，該藥可能通過(guò)降低α-SMA水平、阻抑細(xì)胞外基質(zhì)合成，糾正大鼠的肺纖維化狀態(tài)。目前已有研究表明在TGF-β1誘導(dǎo)的纖維母細(xì)胞分化為成肌纖維細(xì)胞的過(guò)程(IPF關(guān)鍵病理過(guò)程)中，可能以NOX4作為媒介促進(jìn)α-SMA和骨膠原Ⅰ的表達(dá)，且能促進(jìn)PDGF誘導(dǎo)的纖維母細(xì)胞的遷移[14]。

由上可見(jiàn)，PDGF在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。在肺纖維化病變過(guò)程中，纖維病灶內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生的PDGF-A可穿越受損傷的上皮細(xì)胞進(jìn)入肺泡間質(zhì)；來(lái)自肺泡腔與肺泡間隔內(nèi)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的PDGF-A可共同趨化間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化[13]。國(guó)內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化的形成與氧化應(yīng)激所致的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子水平失衡有關(guān)，其中PDGF是重要的致纖維化生長(zhǎng)因子，在纖維化早期分泌增多、表達(dá)增強(qiáng)[15]，啟動(dòng)肺纖維化過(guò)程，形成不可逆性的肺損傷。

本研究結(jié)果顯示，給藥第7、28天時(shí)，模型組肺組織中PDGF-A mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其余各組；給藥第28天時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組肺組織中PDGF-A mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組，實(shí)驗(yàn)1、2、3組肺組織中PDGF-A mRNA相對(duì)表達(dá)量低于陽(yáng)性對(duì)照組。上述結(jié)果提示人參皂苷Rg1作用后，肺纖維化大鼠肺組織PDGF-A mRNA表達(dá)減少，可能會(huì)使纖維化細(xì)胞的侵襲能力降低或纖維化細(xì)胞凋亡，從而產(chǎn)生治療肺纖維化的作用[16]。然而，人參皂苷Rg1調(diào)節(jié)α-SMA水平和PDGF-A mRNA表達(dá)的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1] Lee AS, Mira-Avendano I, Ryu JH, et al. The burden of idiopathic pulmonary fibrosis: an unmet public health need[J]. Respir Med, 2014,108(7):955-967.

[2] Raghu G, Collard HR, Egan JJ, et al. An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement: Idiopathic pulmonary fibrosis: Evidence-based guidelines for diagnosis and management[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2011, 183:788-824.

[3] Li L, Li D, Xu L, et al. Total extract of Yupingfeng attenuates bleomycin-induced pulmonary Fibrosis in rats[J]. Phytomedicine, 2015,22(1):111-119.

[4] Nair GB, Matela A, Kurbanov D, et al. Newer developments in idiopathic pulmonary fibrosis in the era of anti-fibrotic medications[J]. Expert Rev Respir Med, 2016,10(6):699-711.

[5] Asano S, Ito S, Takahashi K, et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts[J]. Physiol Rep, 2017,5(9):1-11.

[6] 吳娟娟，凌春華，何煥榮，等.復(fù)方三七飲對(duì)博萊霉素致大鼠肺纖維化TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013,29(9):927-930.

[7] Palaniyandi SA, Suh JW, Yang SH, et al. Preparation of ginseng extract with enhanced levels of Ginsenosides Rg1 and Rb1using high hydrostatic pressure and polysaccharide hydrolases[J]. Pharmacogn Mag, 2017,13(Suppl 1):142-147.

[8] Zhan H, Huang F, Ma W, et al. Protective effect of ginsenoside Rg1 on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats: involvement of caveolin-1 and TGF-β1signal pathway[J]. Biol Pharm Bull, 2016,39(8):1284-1292.

[9] 吳樹(shù)才,楊永輝,李輝,等.人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠肺纖維化的影響及機(jī)制[J].山東醫(yī)藥，2016,56(12):13-15.

[10] Zhai HQ, Hhang JR, Gao MC, et al. Comparative study between Ephedra sinica Stapf and Fructus Schisandrae Chinensis on ET-1 and 6-keto-prostaglandin F1α in rats with idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Genet Mol Res, 2014,13(2):3761-3771.

[11] Sabry MM, Elkalawy SA, Abo-Elnour RK, et al. Histolgical and immuno- histochemical study on the effect of stem cell therapy on bleomycin induced pulmonary fibrosis in albino rat[J]. Int J Stem Cells, 2014,7(1):33-42.

[12] Lucattelli M, Fineschi S, Selvi E, et al. Ajulemic acid exerts potent anti-fibrotic effect during the fibrogenic phase of bleomycin lung[J]. Respir Res, 2016,17(1):49.

[13] 寧康,王超,董延春,等.補(bǔ)腎宣肺活血方對(duì)肺纖維化大鼠肺組織TGF-β、Smad3蛋白和PDGF表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥,2011,51(29):30-31.

[14] Amara N, Goven D, Prost F, et al. NOX4/NADPH oxidase expression is increased in pulmonary fibroblasts from patients with idiopathic pulmonary fibrosis and mediates TGF beta1-induced fibroblast differentiation into myofibroblasts[J]. Thorax, 2010,65(8):733-738.

[15] Zhu X, Fang X, Chen W, et al. Lower expression of platelet derived growth factor is associated with better overall survival rate of patients with idiopathic nonspecific interstitial pneumonia[J]. J Thorac Dis, 2017,9(3):519-528.

[16] Kusko RL, Brothers JF, Tedrow J, et al. Integrated genomics reveals convergent transcriptomic networks underlying chronic obstructive pulmonary disease and idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2016,194(8):948-960.

新鄉(xiāng)市重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(S10008)。

詹合琴(E-mail: xiaofei1@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.27.011

R563

A

1002-266X(2017)27-0040-03

2016-10-24)