王斌，楊銳 ，李思聰，張敏，李金良，李旭廷*

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066)

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黃芩苷對大鼠口服非索非那定的藥動學(xué)影響

王斌1,2，楊銳1,2，李思聰1,2，張敏1,2，李金良1,2，李旭廷1,2*

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066)

為了研究黃芩苷對大鼠口服非索非那定藥動學(xué)及P-糖蛋白(P-gp)表達(dá)的影響，將SD大鼠36只隨機(jī)分為A、B、C三組，連續(xù)灌胃7 d，A組給予黃芩苷200 mg/kg，B組蒸餾水空白對照，C組維拉帕米藥物對照(10 mg/kg)，第8天灌胃后2 h，各組隨機(jī)取6只大鼠處死，解剖并迅速取出肝臟、空腸，熒光定量PCR測定各組織P-gp的mRNA表達(dá)水平。各組另外6只大鼠灌胃后同時給予非索非那定(30 mg/kg)，按時間點連續(xù)采集血樣，采用高效液相色譜法測定非索非那定血藥濃度。結(jié)果表明，黃芩苷對非索非那定的吸收有明顯促進(jìn)作用，主要表現(xiàn)在黃芩苷組非索非那定峰濃度(Cmax)比空白對照組顯著增加17.04%(P<0.05)，曲線下面積AUC(0-12)顯著增加19.23%(P<0.05)，黃芩苷減少了大鼠空腸和肝臟P-gp的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論：黃芩苷能下調(diào)大鼠P-gp表達(dá)，增加P-gp底物非索非那定在大鼠體內(nèi)的生物利用度，是一種P-gp抑制劑。

黃芩苷；非索非那定；藥動學(xué)；熒光定量；P-糖蛋白

黃芩苷是黃芩中主要活性成分，屬于黃酮類化合物，具有抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[1-2]。黃芩苷與多種藥物存在相互作用，其與化學(xué)藥的相互作用問題越來越受到重視[3-5]。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由1280個氨基酸組成的跨膜蛋白，在藥物吸收、分布、代謝及排泄方面有重要的作用[6]。含有黃芩及黃芩苷的中藥制劑在獸醫(yī)臨床應(yīng)用非常廣泛，研究黃芩苷對藥物轉(zhuǎn)運蛋白P-gp的影響對指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要意義。本研究以非索非那定藥動學(xué)參數(shù)作為體內(nèi)P-gp活性的探針，通過觀察黃芩苷對非索非那定大鼠體內(nèi)藥動學(xué)及肝臟和空腸P-gp表達(dá)的影響來探討黃芩苷對P-gp活性的影響，為臨床黃芩苷的藥物配伍使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀，美國戴安公司；WH-3微型漩渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠；Eppendorf MiniSpin plus離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；CQ250超聲洗滌器，上海超聲儀器廠；MD200-1氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司。H6-1微型電泳槽，上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，北京君意；T6紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀，BIO公司； StepOne型熒光定量PCR儀，ABI。

1.2 試劑與藥品 非索非那定對照品(批號：100852-201202)，非那西丁對照品(批號：100095-201205)，維拉帕米對照品(批號：100223-200102)，黃芩苷對照品(批號：110842-201207)，對照品購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇、乙腈為色譜級，其它試劑為分析純。Trizol提取試劑盒，4S Red Plus核酸染色劑，第一鏈cDNA合成試劑盒，上海生工生物工程有限公司。

1.3 試驗動物 健康清潔級SD雄性大鼠，體重(200±20) g，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK(川)2013-24。整個試驗期間，于室溫20 ℃～24 ℃下飼養(yǎng)，每天供給飼料及純化水，采血前12 h限飼。

2 方 法

2.1 試驗分組 體重相近雄性大鼠36 只，隨機(jī)分為3 組，每組12 只。灌胃給藥，A組黃芩苷200 mg/kg；B組灌注相同體積的蒸餾水，C組灌注維拉帕米10 mg/kg，每日1次，所有受試大鼠連續(xù)灌胃7 d，12 h禁食后，第8天，各組隨機(jī)挑選6只大鼠，灌藥后2 h斷頸處死，解剖并迅速取出肝臟、空腸，樣品置液氮凍存待檢。各組另外6只灌胃后，立即口服非索非那定30 mg/kg，分別于服藥后0、0.083、0.25、0.5、0.75、l、1.5、2、3、4、6、8、12 h斷尾采血，3000 r/min離心和分離血漿，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 血漿樣品的處理 取血漿樣品100 μL，加入等體積的乙腈，渦旋3 min，12000轉(zhuǎn)離心5 min，取上清液置于另一離心管中，氮吹儀吹干，用流動相100 μL溶解，渦旋1 min，取20 μL進(jìn)樣。

2.3 液相色譜法測定非索非那定血藥濃度 色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶0.5%磷酸二氫鉀(pH3.8)：三乙胺(30∶70∶0.3)；流速：1.0 mL·min-1；UV檢測波長：210 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。在上述色譜條件下，非索非那定與非那西丁、溶劑峰、血漿及其他組分能完全分開，該方法血漿的定量限為0.054 μg/mL。

血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在0.054～21 μg/mL之間，線性關(guān)系良好。在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，回收率為99.7%～101.4%，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)分別為2.67%～5.64%和3.12～4.85%。

2.4 熒光定量PCR檢測大鼠肝、空腸P-gp表達(dá) 用于UNIQ-10 柱式 Trizol 總RNA抽提試劑盒提取各組樣品RNA，按常規(guī)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為25 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆?。將cDNA樣品稀釋8倍作為模板上機(jī)檢測，最終擴(kuò)增反應(yīng)按95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性7 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共45循環(huán)。所有樣品檢測均含有一個平行樣本，并包含1個無模板的陰性對照以排除假陽性結(jié)果，以GAPDH 管家基因作為內(nèi)標(biāo)，對基因P-gp的mRNA表達(dá)進(jìn)行相對定量分析，將所得Ct按照2-(△△Ct)方法進(jìn)行計算分析統(tǒng)計結(jié)果。

表1 實時熒光定量RT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of real time fluorescent quantitative RT-PCR

2.5 數(shù)據(jù)分析 采用藥動學(xué)分析軟件DAS3.0，以非房室模型處理血漿濃度-時間數(shù)據(jù)，獲得藥動學(xué)參數(shù)，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t 檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 藥物動力學(xué)結(jié)果 各組大鼠體內(nèi)的非索非那定血藥濃度-時間曲線見圖1，主要藥物動力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，黃芩苷和維拉帕米誘導(dǎo)后，與對照組相比，非索非那定血藥濃度-時間曲線下面積AUC(0-12)顯著增加(P<0.05)，達(dá)峰濃度(Cmax)顯著升高(P<0.05)，達(dá)峰時間(Tmax)、半衰期(t1/2)、平均駐留時間MRT(0-12)、清除率(CLZ/F)各組差異不顯著。

3.2 大鼠肝、空腸P-gp蛋白mRNA的表達(dá) 熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果見圖2，維拉帕米和黃芩苷誘導(dǎo)對大鼠肝、腸的P-gp mRNA表達(dá)量有下調(diào)作用(P<0.05)，且維拉帕米的下調(diào)程度大于黃芩苷。

圖1 各組灌胃后非索非那定的血藥濃度-時間曲線 Fig 1 Plasma concertration-time curves of fexofenadine in the different groups(x±s，n=6)

參數(shù)ParametersA組AgroupB組BgroupC組CgroupCmax/(mg﹒L-1)7.190±1.182*6.143±0.7818.202±0.841*Tmax/h1.503±0.7861.526±0.1471.482±0.214AUC(0-12)/(mg·L-1·h)19.608±2.556*16.445±2.67720.468±2.452*t1/2/h2.343±0.4162.134±0.2052.148±0.337MRT(0-12)/h2.718±0.4682.903±0.3322.540±0.275CLZ/F/(L·h-1·kg-1)1.521±0.2031.495±0.1681.593±0.281

*0.05水平上差異顯著

*Significant difference at 0.05 levels

* 0.05水平上差異顯著* Significant difference at 0.05 levels圖2 各試驗組大鼠肝、空腸P-gp mRNA表達(dá)水平(x±s，n=6)Fig 2 expression level of P-gp mRNA in the live and jejunum of different group (x±s，n=6)

4 討 論

黃芩苷為中藥黃芩的主要活性成分之一，以黃芩提取物入藥的制劑在獸醫(yī)臨床應(yīng)用廣泛，如雙黃連注射液、銀黃注射液、清開靈注射液等，且多以中西藥配伍使用[7]，聯(lián)合使用的藥物大多具有藥效的協(xié)同作用，同時也可能有相似代謝或轉(zhuǎn)運途徑，表現(xiàn)為藥動學(xué)特征的改變，P-gp介導(dǎo)的相互作用最為常見?；赑-gp抑制機(jī)制的相互作用往往會使其底物的療效增加，生物利用度提高，因此，對P-gp抑制劑藥物的研究，在指導(dǎo)臨床聯(lián)合用藥及解決多藥耐藥問題都具有重要意義。

Tsuruo等[8]證實維拉帕米對P-gp有抑制作用，可阻礙藥物外排，提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，改善治療藥物的體內(nèi)生物利用度，而非索非那定是藥物轉(zhuǎn)運體P-gp 和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運體的底物，由于它在體內(nèi)不被代謝，常用來作為體內(nèi)評價P-gp 轉(zhuǎn)運行為的探針?biāo)幬颷9]。本研究以維拉帕米作為陽性對照藥物，以非索非那定作為體內(nèi)P-gp的探針?biāo)幬?，通過觀察黃芩苷對非索非那定藥動學(xué)的影響，探討黃芩苷對P-gp的影響。結(jié)果顯示，維拉帕米對非索非那定主要藥動學(xué)參數(shù)影響明顯，Cmax和AUC(0-12)較空白組顯著增加，表明維拉帕米提高了非索非那定在大鼠體內(nèi)的生物利用度，呈現(xiàn)出P-gp抑制劑的特性。黃芩苷對非索非那定的藥動學(xué)參數(shù)的改變趨勢與維拉帕米一致，提示黃芩苷可能也是P-gp抑制劑。韋靈玉等[10]將黃芩提取液大鼠連續(xù)灌胃一周，體外評價P-gp底物羅丹明123和非P-gp底物熒光素鈉經(jīng)大鼠空腸黏膜吸收方向和分泌方向的轉(zhuǎn)運變化，發(fā)現(xiàn)黃芩提取液對P-gp活性具有抑制作用。范嵐[11]研究了黃芩苷對P-gp底物他林洛爾藥代動力學(xué)影響，表明黃芩苷能顯著提高他林洛爾Cmax和AUC(0-12)，顯示黃芩苷可以抑制P-gp活性，與本研究結(jié)果一致。 除探針?biāo)幬锿?，利用熒光定量PCR開展藥物轉(zhuǎn)運體、代謝酶的mRNA表達(dá)也是研究藥物-藥物影響和藥物代謝的重要方法。Miao Q等[12]利用Caco-2細(xì)胞比較了黃芩素和黃芩苷對的P-gp活性和表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)黃芩素對P-gp活性和表達(dá)水平抑制作用明顯，而黃芩苷對P-gp的表達(dá)無影響。本研究選擇大鼠進(jìn)行體內(nèi)試驗，熒光定量PCR檢測誘導(dǎo)給藥后大鼠的肝臟和腸道P-gp mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示，黃芩苷連續(xù)誘導(dǎo)給藥，可下調(diào)大鼠肝臟和腸道P-gp的表達(dá)，增加藥物在腸道吸收，提高藥物的生物利用度，這與藥動學(xué)試驗結(jié)果一致。大鼠體內(nèi)試驗結(jié)果和其他學(xué)者體外試驗結(jié)果的差異，應(yīng)與大鼠口服黃芩苷后，在腸道內(nèi)大部分被菌群轉(zhuǎn)化為黃芩素后再吸收有關(guān)[13]。

綜上所述，黃芩苷通過下調(diào)藥物轉(zhuǎn)運蛋白P-gp的表達(dá)來提高P-gp底物在大鼠體內(nèi)的吸收，提高了藥物的生物利用度，然而大鼠體內(nèi)存在種類眾多的轉(zhuǎn)運蛋白，且藥物的吸收代謝還受到肝藥酶的影響[14]，因此尚需對此進(jìn)行進(jìn)一步的研究，更加明確其作用機(jī)制，為黃芩苷在臨床的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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(編輯：陳希)

Effects of Baicalin on Pharmacokinetics of Fexofenadine in Ratsinvivo

WANG Bin1,2, YANG Rui1,2,LI Si-cong1,2, ZHANG Min1,2,LI Jin-liang1,2, LI Xu-ting1,2*

(1.InstituteofVeterinaryPharmacology,SichuanAnimalScienceAcademy,Chengdu610066,China; 2.SichuanAnimalBreedingandGeneticsKeyLaboratoryofSichuanProvince,Chengdu610066,China)

LIXu-ting,E-mail: 676049640@qq.com

To investigate the effects of baicalin on the pharmacokinetics of fexofenadine and the expression level of P-gp in rats,36 SD rats were randomly divided into A,B and C groups, rats in A group were oral administered with baicalin(200 mg/kg), B with distilled water and C with verapamil (10 mg/kg) respectively for 7 d. On the 8th d, After 2 h of administering, 6 rats in each group were killed .The liver and jejunum were collected respectively to evaluate the P-gp mRNA expression level by real-time fluorescent quantitative PCR. The other rats were administered with fexofenadine(30 mg/kg). The concentrations of fexofenadine in plasma after administration were determined by HPLC. After administered with baicalin, Cmaxand AUC(0-12)of nifedipine were significantly increased, and the level of P-gp mRNA expression in liver and jejunum were decreased. It is concluded that baicalin is an inhibitor of P-gp, which can enhance the bioavailability of nifedipine and decrease the level of P-gp mRNA expression significantly

baicalin；fexofenadine；pharmacokinetics；real time PCR；P-gp

四川省公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目(SASA2015A16)；四川省財政運行專項(SASA2014CZYX010) 作者簡介： 王斌，碩士，從事新獸藥的開發(fā)與應(yīng)用工作。

李旭廷。 E-mail: 676049640@qq.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.10

2017-02-23

A

1002-1280 (2017) 07-0052-05

S859.79