朱慶賀，苗艷，王爽，陳曦，王觀悅，史同瑞

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006)

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高效液相色譜法測(cè)定利福昔明混懸乳劑的含量

朱慶賀，苗艷，王爽，陳曦，王觀悅，史同瑞*

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006)

建立了測(cè)定利福昔明混懸乳劑含量的高效液相色譜法(HPLC)。采用C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，以甲醇-乙腈-0.075 mol/L磷酸二氫鉀溶液-1 mol/L檸檬酸溶液(32∶28∶25∶4)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)236 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25 ℃。利福昔明濃度在5～100 μg/mL時(shí)，其峰面積與濃度線性關(guān)系良好(r2=0.9996)，無雜質(zhì)干擾，穩(wěn)定性高，回收率范圍為98.4%～100.2%，RSD為0.58%～1.32%。本操作方法簡(jiǎn)便、分析快速、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于利福昔明混懸乳劑的含量測(cè)定。

利福昔明；混懸乳劑；高效液相色譜法；含量

利福昔明是利福霉素衍生物，是一種高效低毒的腸道抗生素。適用于革蘭氏陽性菌及陰性菌、需氧及厭氧細(xì)菌所致急慢性腸道感染等癥。在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，利福昔明主要用于治療腸道感染、腹瀉、小腸結(jié)腸炎等病癥[1-2]。但是，近年來獸醫(yī)領(lǐng)域也有相關(guān)應(yīng)用的報(bào)道，其藥物劑型主要有干混懸劑、噴霧劑和混懸液[3-4]。而本實(shí)驗(yàn)室成功研制了利福昔明混懸乳劑，具備穩(wěn)定性好，生物相容性好，緩釋效果顯著的特點(diǎn)，為利福昔明的獸醫(yī)臨床應(yīng)用提供了一種新的藥物劑型，首次建立了針對(duì)此劑型的HPLC含量測(cè)定法。該測(cè)定方法能夠?yàn)槔Ｎ裘骰鞈胰閯﹦┬偷拈_發(fā)提供一定的參考價(jià)值，對(duì)于該劑型的穩(wěn)定性研究、藥代動(dòng)力學(xué)研究以及進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)都具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 材料 利福昔明對(duì)照品，含量95.7%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；利福昔明混懸乳劑(自制)，規(guī)格為：2%利福昔明混懸乳劑；乙腈/甲醇均為色譜純，賽默飛世爾科技公司 ；磷酸二氫鉀/檸檬酸，天津天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器 電子分析天平，MS104TS/02型，梅特勒-托利多(上海)有限公司； InertSustain C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；高效液相色譜儀，LC-20AT SPD-20A，SHIMADZU；純水儀，XYE2-20-H型，北京湘順源科技有限公司；實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)，F(xiàn)E20型，梅特勒-托利多(上海)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；注溫：25 ℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)236 nm；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.075 mol/L磷酸二氫鉀溶液-1 mol/L檸檬酸溶液(32∶28∶25∶4)。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的利福昔明對(duì)照品(p=95.7%)10 mg，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成100 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得濃度為20 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取樣品適量(相當(dāng)于利福昔明20 mg)，置100 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相充分溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取此液1 mL置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液制備 按配方比例量取與供試品相當(dāng)?shù)目瞻兹閯?與利福昔明混懸乳劑相比只是不含利福昔明，其他成分相同)適量，按照供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn) 分別量取利福昔明對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果見圖1。在該色譜條件下，利福昔明的保留時(shí)間k為6.9 min左右，陰性對(duì)照在此時(shí)間附近沒有出峰，因此對(duì)利福昔明HPLC的測(cè)定沒有影響，專屬性能滿足檢測(cè)要求。

圖1 HPLC圖譜Fig 1 The HPLC chromatogram

2.4 線性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、2.0、4.0、8.0、10 mL分別置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為5、20、40、80、100 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積(y)對(duì)利福昔明的濃度(x，μg/mL)進(jìn)行線性回歸方程，方程為y=65047x+48715，r2=0.9996。結(jié)果表明利福昔明在5～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 回收率測(cè)定 取2.2.1項(xiàng)制備的100 μg/mL儲(chǔ)備液，分別精密取適量?jī)?chǔ)備液并添加配方劑量的空白懸浮乳劑基質(zhì)，超聲溶解后，用流動(dòng)相稀釋成低(L=10 μg/mL )、中(M=50 μg/mL)、高(H=80 μg/mL)3種理論濃度的對(duì)照品，每個(gè)濃度配制3份，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果表明高、中、低濃度對(duì)照品的回收率范圍為98.4%～100.2%，RSD為0.58%～1.32%。該方法回收率符合要求。

圖2 利福昔明標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 The standard curve of rifaximin

表1 利福昔明的回收率Tab 1 Recovery rate of Rifaximin

回收率R%=實(shí)測(cè)濃度/理論濃度×100%

2.6 精密度試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)制備的100 μg/mL儲(chǔ)備液，精密取適量?jī)?chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋成20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定其峰面積。結(jié)果表明RSD為0.97%，精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)制備的100 μg/mL儲(chǔ)備液，精密取適量?jī)?chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋成20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、10、12 h測(cè)定其峰面積。結(jié)果表明平均峰面積為1298966，RSD為1.05%。表明本品在12 h內(nèi)含量穩(wěn)定。

2.8 樣品含量測(cè)定 精密量取3批次的利福昔明混懸乳劑樣品，每批次3份，按2.2.2項(xiàng)制成供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，批號(hào)為20141201、20160315、20161031的3批樣品中利福昔明平均含量分別為標(biāo)示量的96.22%、99.39%、101.22%，符合規(guī)定。

3 討論與小結(jié)

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)和色譜柱的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，利福昔明在240 nm附近有較大吸收。因此初選240、254、236 nm波長(zhǎng)下測(cè)定利福昔明混懸乳劑中利福昔明的含量。通過色譜結(jié)果的比較分析，在236 nm波長(zhǎng)下測(cè)定，能夠獲得最大的靈敏度和抗干擾能力，本試驗(yàn)中選擇236 nm作為利福昔明含量的檢測(cè)波長(zhǎng)。

色譜柱中C8和C18都是反相色譜柱的一種，適用于分析弱極性的物質(zhì)，C8在弱極性較強(qiáng)的一側(cè)，C18在極性較弱的一側(cè)，但是差別并不是十分明顯，在加上C18較C8具有更好的保留特性，本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]方法選擇了C18色譜柱。試驗(yàn)證明，利用C18色譜柱進(jìn)行色譜分析分離度好，適用于利福昔明混懸乳劑含量的測(cè)定。

3.2 利福昔明混懸乳劑 利福昔明是人工半合成抗菌藥[2]，具有廣譜殺菌作用，對(duì)革蘭陽性菌，如金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌，以及革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、巴氏桿菌均具有良好的殺滅效果，而這些細(xì)菌恰恰又是引起奶牛乳房炎發(fā)生的主要病原微生物。另一方面，利福昔明的藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，利福昔明在口服后基本無系統(tǒng)吸收，只在局部發(fā)揮高效的抗菌作用。綜上所述，利福昔明可以作為一種良好的奶牛乳房局部作用型抗菌藥物。郭旭[8]等利用制備的利福昔明乳房注入劑對(duì)干奶期奶牛臨床型乳房炎的預(yù)防效果進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明，利福昔明高劑量組對(duì)干奶期奶牛臨床型乳房炎的預(yù)防效果與空白對(duì)照組相比，差異極顯著(P<0.01)，說明利福昔明對(duì)臨床型乳房炎有較好的預(yù)防效果。

本實(shí)驗(yàn)室成功研制了利福昔明混懸乳劑，兼具了利福昔明和混懸乳劑的共同優(yōu)點(diǎn)，是奶牛乳房炎防治的一種創(chuàng)新劑型。建立了利福昔明混懸乳劑中利福昔明的HPLC的檢測(cè)方法，本方法分離度好，利福昔明的保留時(shí)間在6.9 min左右，峰形好，基本無拖尾，雜質(zhì)不干擾試驗(yàn)測(cè)定，而且采用外標(biāo)法測(cè)定利福昔明混懸乳劑的含量操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，回收率高，重現(xiàn)性好，是利福昔明懸浮乳劑中利福昔明含量測(cè)定的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法。

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(編輯：陳希)

Content Determination of Rifaximin Suspo-emulsions by HPLC

ZHU Qing-he, MIAO Yan, WANG Shuang, CHEN Xi, WANG Guan-yue, SHI Tong-rui*

(HeilongjiangInstituteofVeterinaryScience,Qiqihar161006,China)

SHITong-rui,E-mail:systr@sina.com

A method for the content determination of rifaximin suspoemulsion by HPLC was established. HPLC system consisted of C18 column(5 μm, 4.6 mm×150 mm), methyl alcohol-acetonitrile-citric acid-potassium phosphate monobasic(32∶28∶25∶4) as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min. The detection wave length was 236 nm. The injection volume was 20 μL and column temperature was room temperature. There was no interference occurred from inpurities. The calibration curve was linear in the range of 5～100 μg/mL(r2=0.9996).The recovery was 98.4%～100.2% andRSDwas 0.58%～1.32%. The method is rapid, simple and accurate for the content determination of rifaximin suspo-emulsions.

rifaximin；suspo-emulsions ；HPLC；content

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)(czznkt2016-2) 作者簡(jiǎn)介： 朱慶賀，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事獸藥研究。

史同瑞。E-mail: systr@sina.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.08

2016-11-25

A

1002-1280 (2017) 07-0042-05

S859.79