孟蕾，周紅霞，李慧素，彭麗，馬浩軒，吳寧鵬*

(1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州 450008；2.鄭州市第七中學，鄭州 450008)

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高效液相色譜法測定飼料中七種水溶性色素

孟蕾1，周紅霞1，李慧素1，彭麗1，馬浩軒2，吳寧鵬1*

(1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州 450008；2.鄭州市第七中學，鄭州 450008)

應用高效液相色譜法建立了飼料中檸檬黃、桔黃、胭脂紅、食品紅、莧菜紅、亮藍、靛藍7種水溶性色素測定的新方法。樣品經(jīng)40 mL乙腈-丙二醇-水-氨水(25∶5∶19∶1)兩次提取，PWAX柱凈化處理后，以0.02 mol/L乙酸銨溶液(pH=5.0)-乙腈為流動相進行梯度洗脫，7種水溶性色素經(jīng)C18柱得到良好分離。7種水溶性色素在0.5(1.0) ～ 50 μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數(shù)均不小于0.999。亮藍的檢出限為0.25 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg；檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、桔黃、食品紅的檢出限為0.5 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg；靛藍的檢出限為1.0 mg/kg，定量限為2.0 mg/kg。飼料樣品在定量限、低、中、高4個加標濃度下，7種水溶性色素的回收率為60.6%～116.1%，相對標準偏差為0.9%～7.3%，結果表明方法適用于飼料中7種水溶性色素的檢測要求。該方法操作簡單、準確、雜質干擾少。

水溶性色素；飼料；高效液相色譜

近年來人工合成色素因其廉價、高效、上色效果好被廣泛應用于食品添加劑中，這類色素包括檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍等。除了作為食品添加劑使用之外，一些不法分子為了提高飼料的色澤，將這類色素添加到飼料中以謀取不法利益。我國農(nóng)業(yè)部公告第2045號公告《飼料添加劑品種目錄(2013)》中對可使用色素的種類有明確規(guī)定，允許添加到家禽的色素有β-胡蘿卜素、辣椒紅、β-阿樸-8′-胡蘿卜素醛、β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯、β，β-胡蘿卜素-4，4-二酮(斑蝥黃)、天然葉黃素，而常見的人工合成色素檸檬黃、日落黃、誘惑紅、胭脂紅、靛藍、食品紅、莧菜紅、亮藍僅允許添加至寵物、觀賞魚飼料中。違禁、違規(guī)色素在飼料中的添加不同于天然色素，會給消費者的健康帶來一定的風險和危害[1]。為了保障消費者的食品安全，建立一種快速有效的同時檢測飼料中多種人工合成水溶性色素的分析方法具有重大意義。目前，有關人工合成水溶性色素檢測的報道很多，但是研究的基質多為化妝品[2]、飲料[3-6]、肉類食品[7-8]等，關于飼料基質中水溶性色素的報道鮮有。根據(jù)已有報道，水溶性色素的檢測方法主要有毛細管電泳法，薄層色譜法、電化學法、液相色譜法[5，7，9-10]和液質聯(lián)用法[4，8，11]。凈化處理主要為直接稀釋法[3-6]、聚酰胺吸附法[12-14]和固相萃取法[6，8，11，15]。本文選用PWAX弱陰離子交換柱凈化樣品，高效液相色譜法同時測定七種色素，方法簡便、快捷、靈敏、準確。

1 材料和方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀，配紫外檢測器 (美國Waters公司)；分析天平(感量0.01 g)；METTLE TOLEDO XP205電子分析天平(感量0.01 mg，梅特勒-托利多儀器公司)；KQ3200E超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；N-EVAP-112氮氣吹干儀 (美國Organomation Associates Jnc公司)。

1.2 試劑 乙酸銨(色譜純，德國Sigma公司)，乙腈(色譜純，德國Sigma公司)，丙二醇(天津、科密歐公司)，氨水(北京化工廠)，乙酸(北京化工廠)為分析純；實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng) (美國Millipore公司) 制備的去離子水。檸檬黃(純度88%)、桔黃(純度90%)、食品紅(純度80%)、胭脂紅(純度70%)、莧菜紅(純度94.7%)、亮藍(純度98%)、靛藍(純度91%)，均購于Dr. Ehrenstorfer公司。

1.3 標準溶液的配制 分別精密稱取檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、靛藍、亮藍、桔黃、食品紅標準品適量，置10 mL容量瓶中，用水稀釋定容，分別配制成1.0 mg/mL的標準儲備液。根據(jù)不同的添加濃度用水分別將其稀釋成相應的標準工作溶液。

1.4 試驗方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18柱，250 mm×4.6 mm，填料粒徑為5.0 μm；流動相A為0.02 mol/L乙酸銨溶液(pH=5.0)，流動相B為乙腈溶液。梯度洗脫，波長變化和梯度洗脫條件見表1和表2；檢測波長為425、500、630 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

表1 波長變化

表2 梯度洗脫條件

1.4.2 樣品前處理 稱取試樣2 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，準確加入提取液乙腈-丙二醇-水-氨水(25∶5∶19∶1)20.0 mL，渦旋混合后，震蕩10 min，水浴超聲提取10 min。10000 r/min離心10 min，移取上清液至另一50 mL離心管中。殘渣中再次加入20.0 mL提取液重復提取一次，合并上清液。準確移取上清液10.0 mL于另一離心管中，加入20.0 mL水，用甲酸調至pH=2.0(±0.2)，混勻后，備用。

PWAX固相萃取柱依次用甲醇和水各5 mL活化，2%甲酸溶液5 mL平衡，將備用液全部過柱。依次用2%甲酸溶液、80%甲醇(1%甲酸水)溶液、甲醇各5 mL淋洗，抽干。10%氨化甲醇溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，40 ℃下氮氣吹干。準確加入水500 μL溶解殘余物，渦動混勻，超聲10 min，過0.22 μm 微孔濾膜，供HPLC測定。

2 結果與分析

2.1 方法的線性范圍及靈敏度 準確量取標準工作溶液適量，用水稀釋，亮藍制得0.5，1.0，2.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列標準溶液，其它色素用水稀釋成濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列標準溶液，由低濃度到高濃度供高效液相色譜儀測定。以色譜峰面積比率為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，如表3所示。

空白試樣按相同步驟處理上機測定后，以信噪比S/N>10計算得到亮藍定量限為0.5 mg/kg，檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、桔黃、食品紅的定量限為1.0 mg/kg，靛藍的定量限為2.0 mg/kg。以信噪比S/N>3計算得到亮藍檢測限為0.25 mg/kg，檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、桔黃、食品紅的檢測限為0.5 mg/kg，靛藍的檢測限為1.0 mg/kg。

表3 7種水溶性色素的回歸方程及相關系數(shù)

2.2 方法的準確度及精密度 結合方法的靈敏度等因素，確定方法在配合料、濃縮料中的添加濃度分別為LOQ(靛藍為2 mg/kg、亮藍為0.5 mg/kg、其他色素為1.0 mg/kg)，5，10和100 mg/kg。每個濃度做5次平行，連續(xù)測定3 d，各化合物的回收率及批內、批間相對標準偏差(RSD)如表4、表5所示，7種水溶性色素的回收率為60.6%～116.1%，相對標準偏差為0.9%～7.3%，本方法顯示了良好的準確度、精密度和重現(xiàn)性。各色素在配合料中的空白色譜圖見圖1。空白配合料加標的色譜圖見圖2。標準溶液的色譜圖見圖3。

3 討論與小結

3.1 液相條件優(yōu)化

3.1.1 檢測波長的確定 用水稀釋七種水溶性色素至10 μg/mL的溶液，進行紫外全掃描，確定每種色素的最大波長。結合可見光波段雜質干擾少和各組分靈敏度兩個因素，選擇425、500、630 nm作為七種水溶性色素的檢測波長。

3.1.2 流動相的確定 本試驗選擇AglientZorbax Eclipse Plus C18(4.6×250 mm，5 μm)作為色譜柱，參考文獻，有機相考察了乙腈和甲醇，水相考察了不同濃度的乙酸銨溶液[8-9](5、10、20、50 mM)，通過比較，結果發(fā)現(xiàn)當水相使用20 mM乙酸銨，pH至調至5.0時，七種水溶性色素峰型較好，無明顯拖尾現(xiàn)象；有機相使用乙腈時柱壓更低，因此選擇乙腈-20 mM乙酸銨(pH=5.0)作為流動相。

表4 濃縮料基質中7種水溶性色素的回收率及相對標準偏差(n=5)

表5 配合料基質中7種水溶性色素的回收率及相對標準偏差(n=5)

續(xù)表

3.2 樣品提取條件的優(yōu)化 參考已報道的文獻，提取水溶性色素使用的提取液有水[7]、乙醇：水(1∶1，V/V)[5]，乙醇∶氨水∶水(7∶2∶1，V/V/V)[2-5]，乙醇∶氨水∶水(80∶1∶19，V/V/V)[4]。首先嘗試使用純水相提取飼料，但飼料基質中含有大量淀粉、蛋白質和脂肪，提取溶液混濁，無法凈化，因此在提取液中加入一定比例的有機相。嘗試使用了乙醇、甲醇和乙腈這三種有機試劑，并將機相比例提高至50%、60%、70%、80%，比較結果發(fā)現(xiàn)使用60%乙腈作為提取液較為理想。同時還考察了提取液酸堿性對色素提取效率的影響，結果表明在堿性條件下色素的回收率更高，分別考察了2%和5%的氨水，兩者提取效果差異不大，但2%氨水更有利于凈化步驟調節(jié)pH值，因此初步將提取液定為乙腈：水：氨水=30∶19∶1(V∶V∶V)。隨后又對配合飼料和濃縮飼料都進行了添加回收試驗，但濃縮飼料中靛藍回收率低，考慮靛藍易溶于丙二醇，分別加入了5%和10%丙二醇溶液，結果表明10%的丙二醇有效提高了靛藍的回收率，最終提取液優(yōu)化為乙腈∶丙二醇∶水∶氨水=25∶5∶19∶1(V∶V∶V∶V)。

3.3 凈化條件的優(yōu)化 本實驗比較了弱陰離子交換柱[8,16]PWAX、C18[6]、HLB和PEP-2固相萃取柱對七種水溶性色素的回收率，實驗結果見表4。PWAX柱、HLB柱和PEP-2柱回收率均可以，但是一方面由于提取液有機相比例較高，過HLB和PEP-2柱之前需稀釋或濃縮提取液來改變溶劑的類型，提取液一經(jīng)濃縮就變的非常混濁，無法過柱，若通過稀釋需要加入大量稀釋液，過柱將花費大量時間；另一方面，HLB柱和PEP-2柱專屬性不強，對飼料凈化效果差，因此選擇了回收率好，專屬性強的PWAX柱。

圖1 空白配合飼料色譜圖

圖2 空白添加配合飼料色譜圖(靛藍為2 mg/kg、亮藍為0.5 mg/kg、其他色素為1.0 mg/kg)

圖3 標準溶液的色譜圖(靛藍為2 mg/kg、亮藍為0.5 mg/kg、其他色素為1.0 mg/kg)

化合物名稱PWAX/%C18/%HLB/%PEP-2/%檸檬黃95.284.697.998.3莧菜紅95.775.396.493.9靛藍10094.198.6107.8胭脂紅93.372.997.496.8桔黃96.991.998.897.9食品紅101.592.598.9103.5亮藍9491.498.192.8

PWAX柱為弱陰離子交換柱，色素在酸性條件下在柱子上有較好的保留，因此需要優(yōu)化提取液的pH值，同時為了保證上樣液合適的離子強度，首先對提取液進行稀釋，取10 mL提取液，加入20 mL水和一定量甲酸，將上樣液pH調至2、3、4、5、6進行測定，當pH值大于等于3時，亮藍已有較大的損失，因此加入甲酸(約3.2 mL)將上樣液pH調至2左右。同時也對淋洗液和洗脫液進行了優(yōu)化，淋洗液為5 mL 2%甲酸溶液，5 mL 80%甲醇(1%甲酸水)，5 mL甲醇。洗脫液為5 mL 10%氨化甲醇。

本方法基于高效液相色譜法，利用弱陰離子交換柱凈化飼料中的雜質，建立了測定飼料中7種水溶性色素的液相色譜法，確定了提取凈化條件以及液相色譜條件，顯示了較好的準確度和精密度，滿足飼料中7種水溶性飼料的檢測要求。

[1] Zhang G G，Yang Z B，Dong S T，Zou Y. 飼料中的天然色素類物質在動物營養(yǎng)中的應用研究進展[J].飼料工業(yè)，2007，28(22):24-28.

[2] Sun X Y, Li Y, Liu L, Zhang C, Li B, Liang T W. Simultaneous determination of 9 water-soluble colorants in cosmetics by high performance liquid chromatography[J].Chinese Jounal of Chromatography，2009，27(6):852-855.

[3] Yang W H, Wang J H, Li X L,etal. A new method research for determination of nature pigment crocin yellow in foods by solid-phase extraction ultrahigh pressure liquid chromatography[J]. J. Chromatogr. A，2011，1218(11):1423-1428.

[4] Zhou T T, He P L, Yasen A,etal. Determination of seven synthetic dyes in animal feeds and meat by high performance liquid chromatography with diode array and tandems mass detectors[J]. Food Chem.，2013，138(2～3):1742-1748.

[5] Stefania B, Giorgio F, Simonetta M, Caprai Elisabetta,etal. Simultaneous determination of synthetic dyes in foodstuffs and beverages by high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detector[J]. Dyes and Pigments，2013，99(1):36-40.

[6] Francisca I A, Maria I F G, Icaro G Pi V,etal. Determination of synthetic food dyes in commercial soft drinks by TLC and ion-pair HPLC[J]. Food Chem.，2014，157: 193-198.

[7] Pu Y X, Wang C H, Yang J Y, Xu X F. Determination of synthetic dyes in cooked meat by high-performance liquid chromatography [J].Chinese Jounal of Health，2009，6(19):1414-1415.

[8] Feng Y C, Ja L, He Y H, Wang J F, Liu Y, Fan X J. Simultaneous determination of 24 industrial dyes in grain and meat products by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J].Chinese Jounal of Chromatography，2013，31(10):1021-1027.

[9] Zhao Y S, Dong Y, Zhang F, Yang M L, Feng F, Chu X G. A Study on System of Sequential Extraction and Cleaning of 46 Forbidden and Limited Synthetic Pigments in Food Stuff[J].Chinese Jounal of Analytical Chemistry，2012，40(2):249-256.

[10]Katerina S M, Christina F, Sakellariou,etal. Determination of 13 synthetic food colorants in water-soluble foods by reverse-phase high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detector[J]. Analytica Chimica Acta，2007，583(1):103-110.

[11]Feng F，Zhao Y S, Yong W,etal. Highly sensitive and accurate screening of 40 dyes in soft drinks by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry[J]. Chromatogr. B，2011，879(20):1813-1818.

[12]GB/T 5009.35-2003.Determination of Synthetic Colour in Foods[S]. National Standards of the People's Republic of China (食品中合成著色劑的測定. 中華人民共和國國家標準).

[13]GB/T 9695.6-2008.Meat products-Determination of artificial colour ponceau 4R[S]. National Standards of the People's Republic of China (肉制品 胭脂紅著色劑測定. 中華人民共和國國家標準).

[14]GB/T 21916-2008.Determination of synthetic colour in fruit tins-High performance liquid chromatography[S]. National Standards of the People's Republic of China (水果罐頭中合成著色劑的測定 高效液相色譜法. 中華人民共和國國家標準).

[15]Gao J, Ning S Y, Xu Z Q. Solid phase extraction-liquid chromatography for Simultaneous determination of inedible pigments in food[J].Chinese Jounal of Analytical Labrotory，2008，27(8):33-35.

[16]Wen J，Sun D H，Hu X K. Simultaneous determination of seven kinds of synthetic pigments in food by SPE-HPLC[J].Chinese Jounal of Health Labrotory Technology，2013，23(7):1717-1719.

(編輯：侯向輝)

Simultaneous Determination of 7 Kinds of Water-soluble Pigments in Feeds by High Performance Liquid Chromatography

MENG Lei1，ZHOU Hong-xia1，LI Hui-su1，PENG Li1，MA Hao-xuan2，WU Ning-peng1*

(1.HenanInstituteofVeterinaryDrugControl,Zhengzhou450008，China；2.ZhengzhouNo.7MiddleSchool,Zhengzhou450008，China)

WUNing-peng,E-mail:wnppeking2002@163.com

A method based on high performance liquid chromatography was developed for quantitative analysis of 7 kinds of water-soluble pigments in feeds. The conditions of sample preparation and analysis were optimized in this thesis. The pigments were firstly extracted with 40 mL of acetonitrile-propanediol-water-ammonia water (25∶5∶19∶1)by twice and purified by PWAX SPE column.A HPLC separation was carried on an Agilent-C18 column (4.6 mm×250 mm，5 μm) with the mobile phase of acetonitrile-0.02 mol/L ammonium(pH=5.0) for gradient elution and detected using a UV detector at 425 nm，500 nm，630 nm. The method was quantified by the external standard method and the linear ranges for 7 kinds of pigments were in the range of 0.5(1.0)-50 μg/mL with correlation coefficients greater than 0.999. The average recoveries ranged from 60.6% to 116.1% of 7 kinds of pigments in feeds at four different levels withRSDless than 7.3%.The limits of detection were 0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，1.0 mg/kg and the limits of quantitation were 0.5mg/kg，1.0 mg/kg，2.0 mg/kg. The results indicated that the method developed was highly sensitive and selective in determination of 7 kinds of water-soluble pigments in feeds.

water-soluble pigments；feeds；high performance liquid chromatography

2016年國家畜禽產(chǎn)品未知危害因子識別與已知危害因子安全性評估項目(GJFP2016007) 作者簡介： 孟蕾，碩士研究生，從事飼料獸藥質量檢測工作。

吳寧鵬。E-mail：wnppeking2002@163.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.07

2016-10-11

A

1002-1280 (2017) 07-0034-08

S859.2