馮華

（云蒙山合作示范牧場(chǎng),四川 宣漢 636150）

改良試管凝集試驗(yàn)和虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)羊布魯氏菌病結(jié)果比較

馮華

（云蒙山合作示范牧場(chǎng),四川 宣漢 636150）

虎紅平板凝集試驗(yàn)方便、快捷，目前已廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖場(chǎng)羊布魯氏菌病的普查，但其假陽(yáng)性情況有待探究。利用改良試管凝集試驗(yàn)對(duì)虎紅平板凝集試驗(yàn)檢出的陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率僅為88.8%。表明虎紅平板凝集試驗(yàn)存在假陽(yáng)性，可先用虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行大面積普查，陽(yáng)性樣品再用改良試管凝集試驗(yàn)復(fù)核。

改良試管凝集試驗(yàn)；虎紅平板凝集試驗(yàn)；布魯氏菌病

布魯氏菌病簡(jiǎn)稱“布病”，有6個(gè)種，即馬耳他布魯氏菌（Brucellamelitensis）、流產(chǎn)布魯氏菌（Br.abortus）、豬布魯氏菌（Br.suis）、林鼠布魯氏菌（Br.neotomae）、綿羊布魯氏菌（Br.ovis）和狗布魯氏菌（Br.canis）［1］。習(xí)慣上稱馬耳他布魯氏菌為羊布魯氏菌，流產(chǎn)布魯氏菌為牛布魯氏菌［2］。各個(gè)種與生物型菌株之間、形態(tài)及染色特性等方面無(wú)明顯差別［3］。布魯氏菌的抵抗力和其他不能產(chǎn)生芽胞的細(xì)菌相似，為細(xì)小的球桿菌、無(wú)鞭毛、有毒力的菌株［4］。流產(chǎn)布魯氏菌主要宿主是牛，而羊、猴、豚鼠有一定易感性；馬耳他布魯氏菌，主要宿主是山羊和綿羊［5］，可以由羊傳入牛群，也可由牛傳播于牛，而其他動(dòng)物對(duì)它的易感性則與流產(chǎn)布魯氏菌相同［6］。檢測(cè)羊布魯氏菌病血清抗體的方法有很多種類，本試驗(yàn)用虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)對(duì)四川省宣漢縣一個(gè)規(guī)模化山羊養(yǎng)殖場(chǎng)和一個(gè)山羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社的1 298份血清樣品進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT），將虎紅平板凝集試驗(yàn)檢出陽(yáng)性的358份樣品再用試管凝集試驗(yàn)（SAT）檢測(cè)對(duì)比［7］，以供廣大養(yǎng)殖場(chǎng)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

待檢樣品1 298份采集于四川省宣漢縣李氏養(yǎng)殖場(chǎng)和專業(yè)合作社，待檢血清樣品放存于-20℃冰箱內(nèi)。

1.2 診斷試劑

布魯氏菌病陽(yáng)性和陰性診斷血清由四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)：川生藥字（2014）4017451。布魯菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原、布魯菌改進(jìn)試管凝集試驗(yàn)抗原同樣由四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)分別是20140812、川生藥字（2014）4017451。微量移液器，96孔U型底微量反應(yīng)板實(shí)驗(yàn)室自購(gòu)。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集及血清制備 采血5mL，1 000 r/min離心5min，取上清液裝入5mL試管置-20℃的冰箱內(nèi)保存。以備檢測(cè)。

1.3.2 虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT） 在潔凈滅菌的平板凝集玻璃板片上標(biāo)注樣品編號(hào)和陰陽(yáng)對(duì)照組，用移液器吸取虎紅平板凝集抗原被檢血清30μL滴入相應(yīng)的檢測(cè)點(diǎn)內(nèi)，再用移液器分別吸被檢樣品30 pμL混合均勻，每吸取一個(gè)樣品更換一次吸頭。在20℃時(shí)反應(yīng)3～5min，以陽(yáng)、陰性血清對(duì)比觀察結(jié)果并記錄。若被檢血清有顆粒狀或絮狀物出現(xiàn)均判為陽(yáng)性，相反則判為陰性。

1.3.3 改良試管凝集試驗(yàn)（MSAT） 血清樣品和標(biāo)準(zhǔn)血清分別稀釋1∶200倍，各血清稀釋液和1∶20倍抗原稀釋液各60μL以100μL移液器加入96孔U型底微量反應(yīng)板中，于平板振蕩器上混勻后將反應(yīng)板以密封膜密封后放置37℃溫箱反應(yīng)，22～24 h后取出觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.4 標(biāo)記原則 100%凝集即反應(yīng)孔底部無(wú)點(diǎn)狀白色沉淀，整個(gè)反應(yīng)孔呈片狀凝集，記做“#”；75%凝集即反應(yīng)孔底部凝集物中稍有點(diǎn)狀白色沉積，75°傾斜反應(yīng)板時(shí)不流，記做“+++”；50%凝集即反應(yīng)孔底部有明顯的凝集物和點(diǎn)狀白色沉積，75°傾斜反應(yīng)板時(shí)微流，即白色沉積物不全部下流，記做“++”；25%凝集即反應(yīng)孔底部有點(diǎn)狀白色沉積，點(diǎn)狀邊緣模糊發(fā)散，75°傾斜反應(yīng)板時(shí)白色沉積物幾乎全流，記做“+”；不凝集即反應(yīng)孔底部?jī)H有點(diǎn)狀白色沉積，75°傾斜反應(yīng)板時(shí)白色沉積物全部下流，記做“－”。反應(yīng)結(jié)果為“++”的為陽(yáng)性，反應(yīng)結(jié)果為“－”的為陰性。

2 檢測(cè)結(jié)果

所采集1 298份羊血清樣品，虎紅平板凝集試驗(yàn)檢出陽(yáng)性樣品358份，陽(yáng)性率27.6%，其中李氏養(yǎng)殖場(chǎng)陽(yáng)性率57.4%，專業(yè)合作社陽(yáng)性率19.0%；利用改良試管凝集試驗(yàn)（MSAT）復(fù)核358份陽(yáng)性樣本，檢出陽(yáng)性樣本318份，陽(yáng)性率88.8%，其中李氏養(yǎng)殖場(chǎng)陽(yáng)性率94.6%，專業(yè)合作社陽(yáng)性率83.8%。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)羊血清結(jié)果

3 分析與討論

通常情況下，RBPT使用方便、快捷，適用于大面積普查，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性［8］。MSAT是我國(guó)布魯氏菌病診斷的法定方法SAT的升級(jí)，既能定性，也能定量，判定容易、檢測(cè)更精準(zhǔn)，也可作為布病早期診斷，但往往因感染動(dòng)物的抗體滴度達(dá)不到檢測(cè)水平，不易檢測(cè)出陽(yáng)性，從而易造成誤診和漏診。且MSAT特異性高，檢測(cè)比較準(zhǔn)確，但操作費(fèi)工、費(fèi)時(shí)［9］，不利于鄉(xiāng)鎮(zhèn)大面積普查。本研究發(fā)現(xiàn)，采用RBPT檢測(cè)羊布魯氏菌病陽(yáng)性檢出率27.6%；采用MSAT檢測(cè)羊布魯氏菌病358份血清樣品，檢測(cè)出陽(yáng)性樣品318份，可疑和陰性樣品共40份，陽(yáng)性檢出率88.8%。本實(shí)驗(yàn)證明了用RBPT檢測(cè)血清樣品可能存在假陽(yáng)性樣品現(xiàn)象，說(shuō)明RBPT可用于養(yǎng)殖場(chǎng)布魯氏菌病的大面積普查的初步篩選，但不能定性定量。因此，可先用RBPT普查，陽(yáng)性樣品再用MSAT復(fù)核，以便作出準(zhǔn)確的判斷［10］。

［1］ 孟茹.布魯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法與血清快速診斷試紙的初步研究［D］.新疆石河子：石河子大學(xué)，2010.

［2］ 劉鳳.豬疥螨病的科學(xué)防治［J］.中國(guó)畜禽種業(yè)，2015（10）：117-118.

［3］ 姜玉嫻，孫雷.應(yīng)用RBPT監(jiān)測(cè)布魯氏菌病誤差原因分析［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2009（4）：41.

［4］ 侯寶華，喬平平，黨志喜.奶牛布病防制主要技術(shù)措施［J］.中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2010（6）：100-101.

［5］ 楊春華，邱昌慶，曹小安.流產(chǎn)布魯氏菌omp25基因的克隆與原核表達(dá)［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2007（6）：465-468.

［6］ 王洪喆.動(dòng)物布病及人間布病的預(yù)防［J］.動(dòng)物保健，2006（9）：31-32.

［7］ 項(xiàng)愛(ài)紅.常規(guī)試管凝集試驗(yàn)與虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)布病抗體結(jié)果對(duì)比分析［J］.河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2016（1）：32-33.

［8］ 樊三忠，劉金彪，陳冬毅，等.虎紅平板凝集試驗(yàn)與試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)奶牛布魯氏菌病的比較［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009（9）：52-53.

［9］ 李鋒，王莉，柴春彥，等.檢測(cè)牛乳中三聚氰胺的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009（9）：47-48，53.

［10］李智偉，馬秀敏，張躍新，等.布魯氏菌的分子生物學(xué)診斷技術(shù)［J］.中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2011（11）：861-864，827.

S826.7

A

2095-3887（2017）04-0069-02

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.020

2017-04-26

馮華（1978-），男，獸醫(yī)師，大專。研究方向：畜牧獸醫(yī)。