劉麗莉 李 玉 王 煥 楊陳柳

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

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酶解—磷酸化協(xié)同改性對卵白蛋白特性與結(jié)構(gòu)的影響

劉麗莉 李 玉 王 煥 楊陳柳

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

為考察酶解和磷酸化協(xié)同改性對卵白蛋白特性和結(jié)構(gòu)的影響，針對酶解和磷酸化協(xié)同改性的卵白蛋白的功能特性變化進行分析，并通過FT-IR、DSC和SEM對協(xié)同改性的卵白蛋白結(jié)構(gòu)變化進行分析。結(jié)果表明，協(xié)同改性后的卵白蛋白的溶解度、凝膠強度、乳化性較酶解后的和未改性的卵白蛋白都有較大的提高，但起泡性和泡沫穩(wěn)定性有所降低；結(jié)構(gòu)上，卵白蛋白因酶解導(dǎo)致其肽鏈發(fā)生斷裂，使得更多的氨基酸殘基暴露出來，α-螺旋和β-折疊均有所增加；協(xié)同改性的卵白蛋白熱變性溫度較酶解的和未改性的卵白蛋白分別升高了7.13，10.19 ℃；此外，由于磷酸基團的嵌入，使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，分子結(jié)構(gòu)由球狀體變成了層疊的片狀結(jié)構(gòu)。關(guān)鍵詞：卵白蛋白；酶解；磷酸化；協(xié)同改性；功能特性；結(jié)構(gòu)分析

雞蛋中含有豐富的蛋白，其中卵白蛋白(OVA)占蛋清蛋白的54%～69%，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[1]。OVA資源豐富，具有良好的營養(yǎng)價值和功能特性，水溶性好，極易被人體消化吸收[2]。它具有蛋白質(zhì)典型的乳化性、凝膠性、起泡性等功能特性，在食品中可作為乳化劑、凝膠劑、起泡劑等，大大提高了其在食品中的應(yīng)用價值。但蛋清粉腥味重、溶解性差、黏度大、受熱易凝固，這些性質(zhì)又限制了它在食品加工中的應(yīng)用[3]。因此，應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆椒▽Φ扒宸鄣奶匦赃M行改造，開發(fā)出功能性的蛋清粉，對于拓展其在食品及其他領(lǐng)域的應(yīng)用將具有非常重要的市場價值。涂勇剛等[4]通過酶解改善蛋清蛋白的起泡性，在蛋清液5 mL、酶解時間45 min、酶添加量38.2 mg、酶解溫度47.5 ℃、pH 6.3的條件下，酶解液的起泡性比原蛋清液提高了140%左右。Li等[5]通過干燥加熱磷酸化分別對蛋清蛋白和OVA進行改性，使得干燥加熱磷酸化改性的蛋清蛋白乳化性、溶解性、熱穩(wěn)定性、持水性等功能特性得到了一定程度的提高，并分析了干燥加熱磷酸化對OVA結(jié)構(gòu)的變化與其功能特性變化之間的聯(lián)系。

目前，提高OVA的功能特性主要通過物理、化學(xué)、酶法實現(xiàn)，但使用協(xié)同改性的方法對OVA進行改性的研究尚未見相關(guān)報道。因此本試驗采用堿性蛋白酶對OVA進行酶解，隨后采用三聚磷酸鈉對酶解產(chǎn)物進行磷酸化改性，探討協(xié)同改性對OVA功能物性和結(jié)構(gòu)的影響，從而使卵白蛋白的功能特性進一步提高，為其在食品行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，以適應(yīng)不同產(chǎn)品的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮雞蛋：洛陽市農(nóng)貿(mào)市場；

三聚磷酸鈉：分析純，鄭州市米萊化工產(chǎn)品有限公司；

氫氧化鉀：分析純，廣東西隴化工試劑廠；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀：分析純，天津市北辰方正試劑廠；

KBr：分析純，天津市光復(fù)經(jīng)濟化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機：Beta2.8LD型，德國CHRIST公司；

超速冷凍離心機：Avanti J-E型，美國Beckman Coulter公司；

均質(zhì)機：FJ-200型，上海標本模型廠；

質(zhì)構(gòu)儀：Instron 5544型，美國Brookfield公司；

FT-IR紅外光譜儀：Perten DA7200型，德國Bruker公司；

差示掃描量熱儀：DSC204F1型，瑞士Mettler-Toledo公司；

電子掃描顯微鏡：JSM-5610LV型，日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 OVA的酶解和磷酸化協(xié)同改性的產(chǎn)物制備 配制質(zhì)量分數(shù)為5%的OVA溶液，調(diào)節(jié)pH至8.2，堿性蛋白酶的添加量為5 500 U/g，在恒溫水浴鍋中以52.5 ℃的溫度反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物置于90 ℃的水浴鍋中加熱5 min，使酶鈍化，冷卻至室溫，4 500 r/min離心10 min，取上清液冷凍干燥，得到OVA的酶解物[6]。

取一定量的OVA酶解物溶于0.02 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，配制成1 g/100 mL的蛋白質(zhì)溶液，調(diào)節(jié)pH至8，三聚磷酸鈉添加量為9%，在30 ℃的條件下反應(yīng)4 h，同時磁力攪拌3 h，采用截留分子量為8 000～12 000的透析袋在4 ℃條件下用蒸餾水透析48 h，冷凍干燥備用。

1.3.2 協(xié)同改性O(shè)VA功能特性的測定

(1) 溶解度的測定：蛋白質(zhì)的溶解度通常采用KOH溶解法[7]測定水溶性氮的含量，稱取1 g 樣品置于燒杯中，準確量取質(zhì)量分數(shù)為2% 的KOH溶液50 mL 與樣品充分混合，磁力攪拌2 h，4 ℃條件下3 500 r/min冷凍離心5 min，室溫下靜置10 min，取上清液15 mL，樣品中總氮含量與上清液中氮含量均用凱氏定氮法測定[8]。溶解度按式(1) 計算：

(1)

式中：

NSI——溶解度，%；

N0——樣品中總氮含量，mg/mL；

N1——溶于2%的氫氧化鉀上清液氮含量，mg/mL。

(2) 凝膠強度的測定：將蛋白樣品溶于0.1 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，配制成濃度為10%的蛋白溶液，取50 mL 于100 mL 燒杯中，用保鮮膜密封，置于80 ℃水浴鍋中加熱1 h，然后立即用冷水沖洗燒杯外壁，冷卻至室溫后的凝膠樣品于4 ℃冰箱中放置12 h，采用質(zhì)構(gòu)儀測定其凝膠強度。

測試條件：探頭為圓柱狀平頭探頭；測試前速5 mm/s，測試速度2 mm/s，距離(探頭與樣品的距離)15 mm。硬度，即探頭在下壓的過程中最大感應(yīng)壓力(單位g)，每份樣品重復(fù)5次，計算其平均值。

(3) 乳化特性的測定：分別取OVA、酶解OVA和協(xié)同改性O(shè)VA，加入一定體積pH 7.4 Tris-HCl緩沖液，將其配制成質(zhì)量濃度為1%的蛋白溶液。取15 mL蛋白溶液和5 mL大豆油，于10 000 r/min均質(zhì)1 min，分別取均質(zhì)后0，10 min的最底層乳化液100 μL加入到100 mL 0.1%的SDS溶液中，用紫外分光光度計在500 nm波長處測定其吸光值，空白為0.1% SDS溶液。乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)分別按式(2)、(3)計算：

(2)

(3)

式中：

EAI——乳化活性指數(shù)，m2/g；

ESI——乳化穩(wěn)定性，%；

A0、A10——乳濁液在0，10 min的吸光值；

φ——油相體積分數(shù)(油的體積/乳濁液的體積)，%；

ρ——蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL。

(4) 起泡性的測定：分別將OVA、酶解OVA和協(xié)同改性O(shè)VA溶于pH 7.4 Tris-HCl緩沖液中，配成5%的蛋白溶液，取50 mL蛋白溶液，記錄起始高度H0，10 000 r/min均質(zhì)2 min后，記錄高度H1，靜置10 min后再次記錄高度H2。蛋白溶液起泡性(FAI)和泡沫穩(wěn)定性(FSI)按式(4)、(5)計算：

(4)

(5)

式中：

FAI——蛋白溶液起泡性，%；

FSI——泡沫穩(wěn)定性，%。

1.3.3 協(xié)同改性O(shè)VA的結(jié)構(gòu)分析

(1) 傅里葉紅外光譜分析：將一定量干燥后的KBr分別與冷凍干燥后的OVA、酶解OVA和協(xié)同改性O(shè)VA按質(zhì)量比100∶1置于瑪瑙研缽中，研磨均勻至混合物為粉末狀，將樣品置于樣品槽中，在壓力10～15 MPa下壓片，將樣品取出，放入樣品室，采用紅外光譜儀在400～4 000 cm-1波長區(qū)間對樣品進行掃描[9]。

(2) 差示掃描量熱分析：分別稱量(5.0±0.1) mg 的OVA、酶解OVA和協(xié)同改性O(shè)VA于鋁坩堝中，樣品升溫范圍為30～300 ℃，升溫速率10 ℃/min，以空白為參比，并做重復(fù)試驗[10]。

(3) 掃描電鏡分析：將導(dǎo)電膠帶均勻地貼在樣片臺上，樣品粉末均勻地散落在導(dǎo)電膠上，把樣品臺朝下使粉與膠未帶接觸的顆粒脫落，用洗耳球吹掉多余的粉末，噴金處理后，利用掃描電鏡觀察其形貌，放大200倍，加速電壓為20 kV。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 通過Origin Pro 8.5軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 協(xié)同改性前后OVA的功能特性

2.1.1 溶解性分析 由圖1可知，在pH 2.5～8.5條件下酶解后的OVA溶解性顯著高于OVA(P<0.05)，而協(xié)同改性O(shè)VA的溶解性顯著高于OVA和酶解OVA(P<0.05)。因為在酶解過程中使蛋白分子斷裂，形成了小分子肽鏈，增加蛋白與水的接觸，使得酶解后的OVA溶解度升高。另外，酶解OVA的溶解度在pH 5.0時最低，而OVA的溶解度在其等電點4.5時最低，表明酶解使OVA等電點升高了。協(xié)同改性O(shè)VA在酶解的基礎(chǔ)上，其肽鏈上又多了極性的磷酸根基團與某些特定基團相結(jié)合，增強了蛋白的水化作用，使水化層上蛋白的厚度增加，導(dǎo)致蛋白分子不易聚集沉降，從而提高了其溶解性[11]。協(xié)同改性O(shè)VA的等電點又降低到4.0，因此通過酶解和磷酸化協(xié)同改性O(shè)VA，既能在一定程度上提高OVA功能特性，又能改善OVA在加工過程中的特性。

圖1 協(xié)同改性前后OVA溶解性分析

2.1.2 凝膠性分析 由圖2可知，酶解顯著改善了OVA的凝膠強度，OVA在熱處理4 d后凝膠強度達到681 g，而酶解后的OVA在熱處理4 d后凝膠強度達到740 g，顯著高于未處理的OVA，酶解使OVA球狀結(jié)構(gòu)破壞，形成了緊密的纖維狀結(jié)構(gòu)。在一定的加熱時間內(nèi)，協(xié)同改性O(shè)VA的凝膠強度明顯高于OVA。當(dāng)加熱到3 d時協(xié)同改性O(shè)VA的凝膠強度達到783 g較OVA提高了180 g，可能是磷酸化改性的蛋白質(zhì)表面電荷發(fā)生變化，在加熱過程中促進了緊密有序的三維空間凝膠結(jié)構(gòu)的形成，使其凝膠強度增大[12]。通過酶解和磷酸化協(xié)同改性O(shè)VA有效改善了OVA的凝膠特性，利于具有特殊功能性食品的加工。2.1.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性分析 由圖3可知，酶解OVA乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性較未改性O(shè)VA分別提高了45.32%，10.46%，因為酶解使得OVA的疏水基團增加，結(jié)合油滴的能力增強[13]，親水基團伸展到水相中，提高了OVA的乳化性和乳化穩(wěn)定性。協(xié)同改性O(shè)VA的乳化活性指數(shù)比OVA的提高了18.46 m2/g，乳化穩(wěn)定性提高了12.44%。主要原因：① 磷酸化改性后，蛋白質(zhì)中引入了PO3-，PO3-增加液滴之間的斥力，易于分子的擴散，更利于蛋白質(zhì)在油/水界面重新排列；② 磷酸化改性使得更多的疏水基團暴露出來，提高了蛋白質(zhì)的親油性，降低了乳化液的表面張力，使之更易形成乳狀液滴[14]。

圖2 協(xié)同改性前后OVA凝膠強度分析

圖3 協(xié)同改性前后OVA的乳化性和乳化穩(wěn)定性分析

Figure 3 Analysis of the emulsifying and emulsifying stability of the OVA before and after the synergistic modification

2.1.4 起泡性和泡沫穩(wěn)定性分析 由圖4可知，酶解會引起OVA起泡性的下降，原因可能是：① OVA分子的肽鏈斷裂，無法形成穩(wěn)定的泡沫黏膜；② 雖然酶解使OVA的溶解性增加，但酶解使其溶液的黏度下降，在攪打和起泡過程中不利于OVA分子在氣液界面上快速吸附[15]。協(xié)同改性O(shè)VA起泡性與OVA相比降低了21.9%，泡沫穩(wěn)定性降低了13.11%。蛋白質(zhì)的起泡性與溶液的溫度、pH值有關(guān)。溫度與蛋白質(zhì)泡沫的形成和穩(wěn)定有直接關(guān)系，溫度太低或太高均不利于蛋白的起泡，蛋白質(zhì)溶液一般在30 ℃時起泡性最好，因此夏季的新鮮雞蛋在攪打過程中易起泡。溶液的pH對蛋白泡沫的形成影響很大，蛋白質(zhì)在等電點時，形成泡沫的能力較差，因此在攪打蛋白時通過調(diào)節(jié)蛋白的pH，以增強蛋白質(zhì)的起泡性[16]。

圖4 協(xié)同改性前后OVA的起泡性與泡沫穩(wěn)定性分析

Figure 4 Analysis of the foaming ability and foam stabilityof the OVA before and after the synergistic modification

2.2 協(xié)同改性前后OVA的結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 傅里葉紅外光譜分析 由圖5可知，OVA(Ⅰ)、酶解OVA(Ⅱ)及協(xié)同改性O(shè)VA(Ⅲ)的紅外圖譜存在一定的差異，說明三者的結(jié)構(gòu)有一定不同。蛋白質(zhì)在紅外區(qū)有若干特征吸收帶，對分析二級結(jié)構(gòu)最有價值的區(qū)域是1 600～1 700 cm-1酰胺Ⅰ帶和1 220～1 330 cm-1酰胺Ⅲ帶[17]；在3 200～3 700 cm-1處為游離羥基的伸縮振動吸收帶。

圖5中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在1 220～1 330 cm-1處都有蛋白質(zhì)的特征吸收峰，但Ⅲ的吸收峰較強，其次是Ⅰ、Ⅱ，說明酶解作用使OVA肽鏈斷裂，蛋白質(zhì)多以二級結(jié)構(gòu)存在，因此酶解處理的蛋白質(zhì)在酰胺Ⅲ帶(1 220～1 330 cm-1)有強的吸收峰；α-螺旋特征吸收頻率為1 290～1 330 cm-1，三者在1 290～1 330 cm-1均出現(xiàn)了蛋白質(zhì)的特征吸收峰，且吸收強度 Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ，說明在酶解和磷酸化后促進了α-螺旋的形成，因為酶解和磷酸化作用引起了N—H鍵變形振動，從而使其在1 290～1 330 cm-1的吸收峰增強；β-轉(zhuǎn)角的特征吸收頻率在1 290～1 265 cm-1，圖中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在1 265～1 290 cm-1處均出現(xiàn)了特征吸收峰，且吸收強度 Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ，說明酶解和磷酸化OVA促進了β-轉(zhuǎn)角的形成，在改性過程中更多氨基酸的殘基游離出來，其中脯氨酸具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)和固定的肽平面角，這種特殊結(jié)構(gòu)能夠在一定程度上促進β-轉(zhuǎn)角形成。

2.2.2 差示掃描量熱分析 差示掃描量熱法(DSC)是用來測定蛋白質(zhì)的熱變性溫度，在系統(tǒng)升溫過程中，是分析溫度與樣品和參比之間量熱差的一種方法。

圖5 紅外光譜圖分析結(jié)果

由圖6可知，三者的DSC熱變性溫度曲線均出現(xiàn)了明顯的放熱峰，原因是蛋白質(zhì)受熱變性導(dǎo)致分子構(gòu)象發(fā)生了變化。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性與其氨基酸組成相關(guān)，疏水性氨基酸比親水性氨基酸比例高的蛋白質(zhì)一般熱穩(wěn)定較好[18]。酶解后的OVA球狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，埋藏在分子內(nèi)部的疏水基被釋放出來，所以酶解OVA的熱變性溫度比OVA的升高6.70 ℃；協(xié)同改性后，OVA球狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，埋藏在分子內(nèi)部的疏水基被釋放出來，所以協(xié)同改性的OVA熱變性溫度較OVA升高了10.19 ℃，說明協(xié)同改性可以提高蛋白的熱變性溫度。

圖6 熱收縮溫度分析結(jié)果

2.2.3 掃描電鏡分析 SEM是通過高倍數(shù)放大樣品，從分子形態(tài)上分析樣品結(jié)構(gòu)。對改性前后的OVA進行SEM分析，結(jié)果見圖7。

由圖7(a)可知，OVA為典型的球蛋白；圖7(b)為酶解OVA，因肽鏈的斷裂，球狀結(jié)構(gòu)遭到破壞；圖7(c)為協(xié)同改性O(shè)VA，可以看出協(xié)同改性后的OVA，因磷酸根與蛋白結(jié)合，使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，形成了層疊的片狀結(jié)構(gòu)。

圖7 改性前后OVA的微觀結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

(1) 通過對OVA、酶解OVA和協(xié)同改性O(shè)VA功能特性進行分析，得出協(xié)同改性O(shè)VA溶解度較酶解OVA和OVA都有較大的提高，凝膠強度分別提高了49，96 g，乳化活性指數(shù)分別提高了4.90，18.46 m2/g，乳化穩(wěn)定性分別提高了1.97%，12.43%，起泡性分別降低了3.72%，20.90%，泡沫穩(wěn)定性分別降低了7.13%，13.11%。

(2) 對OVA、酶解OVA和協(xié)同改性O(shè)VA進行結(jié)構(gòu)分析，通過FT-IR光譜、DSC、SEM分析表明：卵白蛋白因酶解導(dǎo)致其肽鏈發(fā)生斷裂，使得更多的氨基酸殘基暴露出來，α-螺旋和β-折疊均有所增加；協(xié)同改性O(shè)VA熱變性溫度較酶解OVA和OVA分別升高了7.13，10.19 ℃；此外，由于磷酸基團的嵌入使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，分子結(jié)構(gòu)由球狀體變成了層疊的片狀結(jié)構(gòu)。

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Effect of the synergistic modification of enzymatic hydrolysis and phosphorylation on functional and structural characteristics of ovalbumin

LIU Li-li LI Yu WANG Huan YANG Chen-liu

(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471023, China)

In this study, effects of the synergistic modification of enzymatic hydrolysis and phosphorylation on the functional properties and structural characterization of ovalbumin were studied. Comparison of functional properties of before and after the synergistic modification of ovalbumin, and the structural changes of the synergistic modification ovalbumin were analyzed by FT-IR, DSC and SEM. The results showed that the solubility, gel strength and emulsifying properties of the synergistic modification ovalbumin were higher than both the enzymatic hydrolyzed and unmodified ovalbumin, whereas the foaming and its stability were reduced. Moreover, the enzymatic hydrolysis of the ovalbumin peptide chain caused more amino acid residues to be exposed, therefore thea-helix andβ-turns increased accordingly. The synergistic modification of ovalbumin thermal denaturation temperature increased by 7.13 ℃ and 10.19 ℃, respectively, compared with the enzymatic hydrolyzed and unmodified one. In addition, due to the embedding of phosphate groups, collaborative modified molecular structure consisted of a spherical body into a laminated sheet structure.

ovalbumin; enzymatic hydrolysis; phosphorylation; synergistic modification; functional properties; structural analysis

國家自然科學(xué)基金(編號：31401622)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(編號：201303084)；河南省重點攻關(guān)項目(編號：152102110080)；河南科技大學(xué)高級別項目培育基金項目(編號：2013ZCX012)；河南省教育廳自然科學(xué)研究項目(編號：13A550255)

劉麗莉(1974—)，女，河南科技大學(xué)副教授，博士。 E-mail：yangliuyilang@126.com

2017—04—18

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.004