李洪超，汪 旭，張玉潔

（1.云南師范大學(xué) 生命科學(xué)院，云南 昆明 650500；2.麻栗坡縣八布中學(xué)，云南 麻栗坡 663605；3.文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099）

碧玉蘭無(wú)菌播種快繁技術(shù)研究

李洪超1，2，汪 旭1，張玉潔3

（1.云南師范大學(xué) 生命科學(xué)院，云南 昆明 650500；2.麻栗坡縣八布中學(xué)，云南 麻栗坡 663605；3.文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099）

以碧玉蘭的種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。結(jié)果表明：碧玉蘭種子萌發(fā)的最佳配方為：MS＋NAA 0.5 mg/L＋AC 2.0 g/L＋蔗糖30 g/L+椰汁100 g/L，播種后50 d左右，可以形成綠色的原球莖（PLB）；原球莖分化成幼苗的最佳配方為：1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L＋蔗糖30 g/L+馬鈴薯100 g/L；生根并形成幼苗最佳的配方為：1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+AC 2.0 g /L+香蕉泥50 g/L。

碧玉蘭；外植體；組織培養(yǎng)

碧玉蘭[Cymbidium lowianum（Rchb.f.）Rchb.f.]，附生植物，花葶長(zhǎng)60～80 cm；每葶10～20朵花；花直徑7～9 cm；唇瓣中裂片上有深紅色的V形斑；花期4～6月份；云南主要分布在盈江、龍陵、滄源、景洪、綠春、文山、金平等地；緬甸和泰國(guó)也有分布；全草入藥，用于跌打、骨折、扭傷、筋傷等。[1]碧玉蘭的花比較大、花色艷麗，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場(chǎng)需求量逐漸增加，而野生碧玉蘭卻越來越少。為了更好地保護(hù)碧玉蘭的種質(zhì)資源，同時(shí)又能滿足市場(chǎng)需求，筆者用碧玉蘭的蒴果作為材料，對(duì)碧玉蘭進(jìn)行了組培快繁研究。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料為成熟度約八成的野生碧玉蘭蒴果。

1.2 方法

首先將碧玉蘭的蒴果用洗滌劑清洗表面，用75%的酒精表面滅菌20 s，然后用0.1%的HgCl2溶液浸泡8 min，最后用無(wú)菌水沖洗2～3次。在超凈工作臺(tái)里將種子均勻地撒在培養(yǎng)基上，基本培養(yǎng)基為1/2MS，活性炭2 g/L，蔗糖30 g/L，瓊脂粉6.0 g/L，在滅菌前將培養(yǎng)基的pH值調(diào)整至6.2，在不同培養(yǎng)階段加入不同種類和配比的激素，不同培養(yǎng)階段加入不同的其它天然有機(jī)物附屬添加成分，按常規(guī)方法配制。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，每天光照12 h，移栽基質(zhì)為較粗的鋸木（杉木）。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)

種子萌發(fā)的培養(yǎng)基共設(shè)置了5個(gè)配方。種子播種后先進(jìn)行遮光培養(yǎng)一周，然后才進(jìn)行光照培養(yǎng)。培養(yǎng)50 d后觀察并統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)情況（見表1和圖1）。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)碧玉蘭種子萌發(fā)的影響

由表1看出，碧玉蘭種子在1/2MS空白培養(yǎng)基中也有萌發(fā)的現(xiàn)象，但萌發(fā)率十分低，只有8%，而在添加NAA和椰汁組合組成的培養(yǎng)基中碧玉蘭種子的萌發(fā)最好。5號(hào)配方中碧玉蘭種子萌發(fā)后形成的原球莖長(zhǎng)得最好。碧玉蘭種子萌發(fā)發(fā)育成綠色圓球形的原球莖團(tuán)塊時(shí)，及時(shí)轉(zhuǎn)瓶，這時(shí)進(jìn)行增殖的效果最好，否則原球莖便開始發(fā)芽分化成幼苗。[2]結(jié)果表明，碧玉蘭種子萌發(fā)最佳的培養(yǎng)基是MS＋NAA 0.5 mg/L＋活性炭1.0 g/L＋蔗糖30 g/L+椰汁100 g/L，萌發(fā)率達(dá)98%，原球莖長(zhǎng)勢(shì)最好。

圖1 種子的萌發(fā)（播種后40天）

圖2 原球莖分化

2.2 原球莖的分化

將原球莖轉(zhuǎn)到1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+馬鈴薯100 g/L分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d左右即可看到原球莖頂端開始分化出芽尖（見圖2）。繼續(xù)培養(yǎng)一個(gè)月后，小芽即可生長(zhǎng)成具有2～4片葉片的幼苗。

2.3 生根培養(yǎng)

活性炭具有很強(qiáng)的吸附能力，對(duì)植物形態(tài)和器官的形成有良好效應(yīng)[3]；香蕉泥、椰汁是成分較復(fù)雜的天然復(fù)合物，對(duì)細(xì)胞和組織的增殖分化有明顯的促進(jìn)作用，對(duì)幼苗生長(zhǎng)發(fā)育也有一定的促進(jìn)作用。[4]因此，試驗(yàn)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同種類的激素和天然添加物，共配制了6種不同配方的生根培養(yǎng)基，每種配方接種10瓶，每瓶接種10株長(zhǎng)勢(shì)差異不大的的無(wú)根苗，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果（見表2）。

由表2可以看出，碧玉蘭在空白培養(yǎng)基1/2MS中也能生根，但生根率也很低，僅為12.0%，長(zhǎng)勢(shì)也不理想；在添加不同種類的激素后，生根率迅速上升，如果在培養(yǎng)基中添加其它天然有機(jī)添加物，碧玉蘭生根效果會(huì)更好。從幼苗的長(zhǎng)勢(shì)上看，5、6號(hào)培養(yǎng)基配方要比4號(hào)培養(yǎng)基配方好，而從經(jīng)濟(jì)成本上看5號(hào)培養(yǎng)基配方比6號(hào)培養(yǎng)基配方更節(jié)約成本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，碧玉蘭最佳的生根培養(yǎng)基配方是：1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭2.0 g/L+香蕉泥50 g/L，生根率達(dá)到100%，植株健壯、葉片顏色濃綠（見圖3）。

表 2 不同生根培養(yǎng)基對(duì)碧玉蘭生根的影響

圖 3 組培苗生根

圖 4 移栽成活

2.4 組培苗的移栽

蘭花試管苗自養(yǎng)能力差，移栽養(yǎng)護(hù)難度較大，在培養(yǎng)壯苗的基礎(chǔ)上應(yīng)注意溫、光、營(yíng)養(yǎng)、基質(zhì)等因素與蘭花生物學(xué)特性相協(xié)調(diào)，使移栽的蘭花逐漸由異養(yǎng)向自養(yǎng)過渡。[4]因此，為了提高碧玉蘭組培苗適應(yīng)自然環(huán)境的能力，在移栽前，將生長(zhǎng)發(fā)育完整的組培苗置于大棚內(nèi)，自然光培養(yǎng)30 d左右即可移栽，大棚內(nèi)避免陽(yáng)光直射及溫度過高。移栽時(shí)，先把瓶蓋打開，用鑷子將苗取出洗凈培養(yǎng)基，再用多菌靈1 000～1 200倍液浸泡組培苗10 min，然后種在濕透的鋸木或者椰糠上。濕度控制在80%～95%之間，定期噴灑殺菌劑，30 d左右即可成活（圖4），成活率達(dá)90%以上。組培苗種植成活長(zhǎng)出新根后才能施肥，否則容易出現(xiàn)爛苗現(xiàn)象。

3 結(jié)論

碧玉蘭的種子非常細(xì)小，每一個(gè)蒴果里面有種子無(wú)數(shù)粒，因此用種子進(jìn)行組培快繁，可達(dá)批量生產(chǎn)的目的，而且不會(huì)傷害到原植株。本試驗(yàn)表明：

1）在培養(yǎng)基中添加10%的椰汁對(duì)碧玉蘭種子的萌發(fā)有明顯促進(jìn)作用。

2）若要大量增殖，用原球莖來增殖效果最好。

3）在原球莖密集的瓶?jī)?nèi)群體生長(zhǎng)十分旺盛，幼苗分化率高，反之則低，表現(xiàn)出一定的群體生長(zhǎng)效應(yīng)[2]；在對(duì)紋瓣蘭無(wú)菌播種快繁技術(shù)研究中也得到類似的結(jié)果。

4）在生根階段的培養(yǎng)基配方中添加50 g/L的香蕉泥對(duì)碧玉蘭組培苗的生根、壯苗有明顯促進(jìn)作用。

[1]吳征鎰，等.云南植物志·第十四卷：種子植物[M].北京：科學(xué)出版社，2003：434.

[2] 張鐵，李洪超，王國(guó)芬.紋瓣蘭無(wú)菌播種快繁技術(shù)研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010（3）：993-995.

[3]譚文澄，等.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1991：268-277.

[4] 何松林，等.碳源和有機(jī)添加物對(duì)文心蘭原球莖增殖的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003（2）：257.

（責(zé)任編輯 張 鐵）

Study on Rapid Propagation Technology of aseptic seeding of Cymbidium lowianum (Rchb.f.) Rchb.f.

LI Hongchao1,2, WANG Xu1, ZHANG Yujie3
(1.School of Life Science,Yunnan Normal University, Kunming 650500,Yunnan, China;
2. Babu Middle School, Malipo County 663605, Yunnan, China; 3. School of Resources and Environment, Wenshan University, Wenshan 663099, Yunnan, China)

Rapid proliferation was done with seeds of Cymbidium lowianum (Rchb.F.) Rchb.F. as explant tissue. Results showed that the seeds can form protocorm in MS medium + NAA0. 5 mg/L + AC1.0 g/L + sugar 30 g/L + coconut milk 100 g/L 50 days after sowing. The best culture medium for differentiation of seedlings from protocorm is 1/2 ms + 6 - BA0.5 mg/L + KT0.5 mg/L + sugar 30 g/L + 100 g/L potato. Differentiated seedlings can be induced to form complete plant in the medium containing 1/2 MS + 6 – BA 0.2 mg/ L + NAA 0.5 mg/L + AC2.0g/L+ Banana juice 50g/L.

Cymbidium lowianum (Rchb.f.) Rchb.f.; Explants; Tissue culture method.

S685.153.8

A

1674 - 9200（2017）03 - 0012 - 03

2017 - 04 - 20

李洪超，男，壯族，云南文山人，麻栗坡縣八布中學(xué)中學(xué)二級(jí)教師，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士研究生，主要從事中學(xué)生物教學(xué)研究；汪旭，女，天津人，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授，博士，主要從事環(huán)境遺傳毒性物質(zhì)、微營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與人類健康之間關(guān)系研究；張玉潔，女，山東臨清人，文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院副教授，博士，主要從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。