鄧小果李貴雨

(1.海南開放大學(xué)農(nóng)林醫(yī)藥科技學(xué)院，海南 ?？?570208;2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 ?？?571101)

澤林考蘭(Zelenkoa onusta(Lindl.)M.W.Chase & N.H.Williams)隸屬文心蘭亞族的單種屬，主要分布在厄瓜多爾和秘魯，附生于海拔0～1200m干旱森林的巖石或樹干上，耐高溫和干旱能力較強(qiáng)。澤林考蘭具有花期長，花序可達(dá)60cm，花色鮮黃色等性狀，觀賞價值高。到目前為止，國內(nèi)對澤林考蘭的研究較少，僅有少數(shù)的植物園引種和小規(guī)模的雜交育種工作。在國際蘭花登錄機(jī)構(gòu)——英國皇家園藝協(xié)會(RHS)登錄的以澤林考蘭為親本的雜交種有15屬66個組合，可以與文心蘭亞族成員廣泛雜交，顯示澤林考蘭較強(qiáng)雜交親和力。

通過化學(xué)誘變育種技術(shù)與植物組織技術(shù)相結(jié)合，具有不受環(huán)境條件限制、節(jié)省大量人工和時間、擴(kuò)大變異譜和提高變異率等優(yōu)點[1,2]，在作物遺傳改良方面具有獨特發(fā)展優(yōu)勢和潛力。秋水仙素誘變多倍體應(yīng)用于多種蘭科植物，已在文心蘭[3-6]、蝴蝶蘭[7,8]、石斛蘭[9]、墨蘭[10]等有相關(guān)研究，這些研究可為蘭科植物多倍體育種提供試驗依據(jù)。本試驗利用已建立的澤林考蘭的離體培養(yǎng)再生體系，以澤林考蘭原球莖為材料，研究秋水仙素處理對其原球莖生長及分化的影響，為澤林考蘭多倍體育種技術(shù)提供理論試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為健壯澤林考蘭原球莖，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 秋水仙素處理

選取生長旺盛，大小基本均勻的澤林考蘭原球莖，在超凈工作臺上用鑷子將其單個剝離，浸入不同濃度的秋水仙素溶液中。秋水仙素的濃度分別為600mg·L-1、800mg·L-1、1000mg·L-1。處理時間為12h、24h、48h，處理后用無菌水沖液沖洗3次；以不加入秋水仙素的無菌水作為對照。

1.2.2 處理材料的培養(yǎng)和觀察

將處理后的原球莖接到繼代培養(yǎng)基(1/2MS加6-BA 2.5mg·L-1加NAA 0.1mg·L-1加蔗糖30g·L-1加卡拉膠7.5g·L-1)中，每個處理接種40個原球莖，每個處理重復(fù)3次，所有材料均在同一條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度26±1℃，每天光照12h，30d后統(tǒng)計死亡率和膨大率。培養(yǎng)過程中觀察原球莖的生長情況。

死亡率(%)=死亡原球莖數(shù)/接種原球莖數(shù)×100%

膨大率(%)=膨大原球莖數(shù)/接種原球莖數(shù)×100%

1.2.3 原球莖分化

將繼代后的原球莖繼續(xù)轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(1/2MS加6-BA 0.5mg·L-1加NAA 0.15mg·L-1加蔗糖30g·L-1加卡拉膠7.5g·L-1)中，接種時已褐變死亡的原球莖不再轉(zhuǎn)接。培養(yǎng)溫度26±1℃，每天光照12h，30d后觀察生長情況并統(tǒng)計分化率。

分化率(%)=分化成芽原球莖數(shù)/接種原球莖數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理對原球莖生長的影響

將處理后的原球莖接到繼代培基中培養(yǎng)觀察，30d后統(tǒng)計其死亡率和膨大率，見表1。隨著秋水仙素濃度的增加及處理時間的延長，部分類原球莖膨大，同時部分原球莖受傷害程度也越明顯，甚至褐化死亡。由表1可知，對照原球莖的死亡率最低，原球莖膨大率為0；秋水仙素處理后原球莖的死亡率均大于30%，死亡率都高于對照，這表明秋水仙素對原球莖生長有抑制作用。處理時間相同時，秋水仙素濃度越高，死亡率越高；處理濃度相同時，處理時間越長，死亡率越高。當(dāng)處理時間為12h和24h時，隨著處理時間的延長，原球莖膨大率增加，當(dāng)處理時間為48h時，原球莖膨大率下降，高濃度原球莖長勢弱，沒有出現(xiàn)原球莖膨大，在后期培養(yǎng)中，慢慢死亡。總體上看，在濃度為1000mg·L-1，處理時間為24h，原球莖的死亡率為51.67%，原球莖膨大率較高，膨大率為21%，長勢良好。

表1 秋水仙素處理對澤林考蘭原球莖生長的影響

2.2 秋水仙素處理對原球莖分化的影響

將繼代培養(yǎng)后存活的原球莖轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中，經(jīng)過秋水仙素處理后的類原球莖出芽時間比對照晚，小芽生長遲緩，出現(xiàn)肉質(zhì)芽，隨著秋水仙素處理濃度時間增大，小芽生長受抑制越明顯，且在生長過程中部分芽逐漸黃化死亡。

從表2可知，處理時間為12h的原球莖分化率均在70%以上，隨著秋水仙素濃度的升高成活率逐漸降低；處理時間為24h的原球莖分化率有所下降，且隨著秋水仙素濃度的升高成活率逐漸降低，處理時間為48h時，僅有濃度為600mg·L-1時分化出苗，且分化率僅為24%。試驗表明，秋水仙素處理時間對原球莖的分化影響較大。當(dāng)處理時間為24h，濃度為1000mg·L-1時，分化率為54%，接近對照組的58%，且出現(xiàn)幼葉變寬變厚。

表2 秋水仙素處理對澤林考蘭原球莖分化的影響

3 討論

多倍體育種是蘭科育種重要方法之一，外植體類型及處理方法都對多倍體的誘導(dǎo)效果有較大影響。植物組織分裂旺盛的時期和部位如類原球莖等是多倍體誘導(dǎo)中常用的材料。崔廣榮等用秋水仙素處理原球莖離體薄切片，再生后的植株都有表現(xiàn)為粗壯、矮化、葉片增寬增厚和葉片線藝等變異[3,4]。用125mg·L-1秋水仙素對朵麗蘭(Dortis pulcherrima)的原球莖進(jìn)行處理7d，發(fā)現(xiàn)原球莖再生率為42%～59%，再生植株中46%為四倍體[11]。采用紫外線照射和秋水仙素處理對春蘭(C.goeringii.)原球莖進(jìn)行處理，再生植株出現(xiàn)變矮、葉片增寬增厚、葉片出現(xiàn)藝蘭等變異性狀[12]。張志勝等用秋水仙素處理墨蘭(C.sinense)和大花蕙蘭(C.hyridus)的雜交Fl種子誘導(dǎo)的原球莖，經(jīng)秋水仙素處理后原球莖的生長和分化起抑制作用，且隨著處理濃度增高抑制作用越強(qiáng)，秋水仙素處理原球莖后的再生植株出現(xiàn)了植株粗壯、多葉、葉片變寬、變厚、葉片墨綠色、矮化、線藝和葉藝等變異類型，變異率為9.06%，其中秋水仙素濃度為0.10%、處理時間為48h時，植株變異率最高[6]。吳彥秋等用秋水仙素處理杜鵑蘭原球莖，試驗表明，隨秋水仙素濃度及處理時間的增加，原球莖的存活率降低，小苗呈現(xiàn)植株粗壯、葉片質(zhì)地較硬、假鱗莖變大、根粗短且數(shù)量少等性狀，不同濃度及處理時間對多倍體誘導(dǎo)率不同，最高誘導(dǎo)率20%[13]。

本研究用不同濃度的秋水仙素溶液處理澤林考蘭原球莖后，原球莖生長和分化都受到不同程度的影響。秋水仙素處理后的原球莖均出現(xiàn)死亡和膨大，隨著濃度增大和處理時間延長，死亡率增大，在分化培養(yǎng)中，隨著處理濃度和處理時間的增加，分化率逐漸下降，小芽生長遲緩，出現(xiàn)肉質(zhì)芽。當(dāng)濃度為1000mg·L-1，處理時間為24h，原球莖的膨大率為21%，死亡率為51.67%，可作為澤林考蘭多倍體誘導(dǎo)參考濃度。